背景[1-3]
人黑色素瘤细胞株源自一位54岁女性，是由D·J·Giard等人建立的一系列细胞株中的一株。A-375细胞在抗胸腺细胞球蛋白、血清处理的NIH瑞士小鼠中形成类似于恶性黑素瘤的快速增长的皮下肿瘤；A-375在普通成纤维细胞和琼脂上形成克隆。
人黑色素瘤细胞株
人黑色素瘤细胞株细胞培养步骤
一．人黑色素瘤细胞株培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM基础培养基87%，
优质胎牛血清10%
GlutaMAX-1谷氨酰胺1%
Sodium Pyruvate丙酮酸钠1%
P/S青霉素-链霉素1%
2）培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．人黑色素瘤细胞株细胞处理：
1）复苏人黑色素瘤细胞株细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人黑色素瘤细胞株细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁人黑色素瘤细胞株细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
人黑色素瘤细胞株细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
1．人黑色素瘤细胞株细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人黑色素瘤细胞株可以用于EGCG和ECG基于PI3K/AKT/mTOR通路调节人黑色素瘤细胞的凋亡和自噬
以4种儿茶素,表没食子儿茶素3没食子酸(Epigallocatechin-3-Gallate,EGCG)、表儿茶素3没食子酸(Epicatechin-3-Gallate,ECG)、表没食子儿茶素(Epigallocatechin,EGC)、表儿茶素(Epicatechin,EC)为研究对象,结合恶性黑色素瘤模型,系统评估其通过凋亡和自噬机制调节黑色素瘤细胞增殖的具体机制,为儿茶素治疗黑色素瘤提供实验依据和理论支持。
主要研究内容如下:(1)不同儿茶素对人黑色素瘤A375细胞增殖的抑制作用。结果显示,4种儿茶素(EGCG、ECG、EGC、EC)里只有EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞的增殖表现出明显的抑制作用,且呈现出时间和剂量依赖性。
(2) EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞凋亡的作用。流式细胞仪实验结果表明,与对照组相比,细胞经过EGCG和ECG处理后凋亡比例增加。EGCG,ECG可诱导A375细胞周期阻滞在G0/G1期;同时,EGCG也可将A375细胞周期阻滞在S期,ECG也可将A375细胞周期阻滞在G2/M期。线粒体膜电位实验表明,EGCG和ECG处理降低细胞内线粒体膜电位。Western blotting实验结果表明,EGCG和ECG处理细胞后,抗凋亡蛋白B细胞淋巴瘤-2基因(B Cell Lymphoma-2 Gene,Bcl-2)表达水平下调,促凋亡蛋白半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Cysteinyl Aspartate Specific Proteinase,Caspase-3)的表达水平上调,促进细胞凋亡。
(3) EGCG和ECG对人黑色素瘤A375细胞自噬的作用。RT-PCR和Western blotting实验结果表明,在基因和蛋白水平上,EGCG和ECG降低沉默信息调节因子3(Sirtuin3,Sirt3)和两个自噬标志物微管相关蛋白1轻链3(Microtubule-associated Protein1-Light Chain 3,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ)和自噬效应蛋白-1(Beclin-1)的表达水平。此外,Western blotting实验检测得到,EGCG和ECG通过抑制腺苷酸激活蛋白激酶/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Adenine Monophosphate-activated Protein Kinase/Mammalian Target of Rapamycin,AMPK/mTOR)和升高磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(Phosphatidylinositol-3-Kinase/Protein Kinase B/Mammalian Target of Rapamycin,PI3K/AKT/mTOR)通路相关蛋白的表达,从而发挥凋亡和自噬调节作用。
(4) 加入自噬激活剂雷帕霉素检测凋亡和自噬两者的关系。结果显示,与对照组相比,加入自噬激活剂雷帕霉素后,自噬标志蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ水平升高,Caspase-3水平升高,Bcl-2水平下降,雷帕霉素诱导A375细胞发生凋亡和升高自噬。与单独使用EGCG和ECG处理后相比,EGCG,ECG和雷帕霉素共处理后LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达依旧显著增加,但细胞凋亡的趋势并没有改变。说明对于人黑色素瘤A375细胞,细胞凋亡和自噬两者是相互独立的关系。
(5) EGCG对裸鼠恶性黑色素瘤的抑制作用。裸鼠腋下注射人源黑色素瘤细胞构建异种黑色素瘤模型,在动物水平上评估EGCG通过凋亡和自噬对黑色素瘤的作用。实验结果表明,与对照组相比,EGCG能够抑制肿瘤体积的增大,上调总的Caspase-3以及或活化型Caspase-3的表达,下调Bcl-2的表达,诱导肿瘤组织凋亡;EGCG下调Beclin-1和LC-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表达水平,从而下调肿瘤组织内自噬水平。
综上所述,儿茶素EGCG和ECG能够抑制黑色素瘤细胞的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞自噬水平,对黑色素瘤具有一定的治疗作用。
参考文献
[1]EGCG Inhibits Tumor Growth in Melanoma by Targeting JAK-STAT Signaling and Its Downstream PD-L1/PD-L2-PD1 Axis in Tumors and Enhancing Cytotoxic T-Cell Responses[J].Ravindran Menon Dinoop;Li Yang;Yamauchi Takeshi;Osborne Douglas Grant;Vaddi Prasanna Kumar;Wempe Michael F;Zhai Zili;Fujita Mayumi.Pharmaceuticals,2021(11)
[2]Apoptosis(programmed cell death)and its signals-A review.[J].Obeng E.Brazilian journal of biology=Revista brasleira de biologia,2021(4)
[3]Outcomes after stereotactic radiosurgery of brain metastases in patients with malignant melanoma and validation of the melanoma molGPA.[J].Kessel K A;Deichl A;Gempt J;Meyer B;Posch C;Diehl C;Zimmer C;Combs S E.Clinical&translational oncology:official publication of the Federation of Spanish Oncology Societies and of the National Cancer Institute of Mexico,2021(10)
[4]Emerging PD-1/PD-L1 antagonists for the treatment of malignant melanoma[J].Vanella Vito;Festino Lucia;Vitale Maria Grazia;Alfano Benedetta;Ascierto Paolo Antonio.Expert Opinion on Emerging Drugs,2021(2)
[5]杜冰心.EGCG和ECG基于PI3K/AKT/mTOR通路调节人黑色素瘤细胞的凋亡和自噬[D].江南大学,2022.