背景[1-3]
中国仓鼠卵巢细胞是源自成年中国仓鼠卵巢深入活体组织切片的CHO细胞的亚克隆，生长需要L-脯氨酸。中国仓鼠卵巢细胞（CHO-K1细胞）可以用于工业生物技术和毒理学研究。
中国仓鼠卵巢细胞
中国仓鼠卵巢细胞培养操作
1）复苏中国仓鼠卵巢细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）中国仓鼠卵巢细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将中国仓鼠卵巢细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）中国仓鼠卵巢细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.中国仓鼠卵巢细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
中国仓鼠卵巢细胞可以用于灵芝孢子粉提取物对中国仓鼠卵巢细胞生长的影响及无血清生长因子筛选方法的构建
中国仓鼠卵巢细胞(CHO)是永生化、能无限增殖的细胞系,是目前重组蛋白药物包括抗体生产的首选表达系统。许多研究工作致力于研发无血清培养基质和适合细胞培养的各种生物反应器用于CHO细胞的规模化培养,试图降低成本及提高产量。灵芝孢子粉(Ganodermalucidum spore,Gls)是一种作中国的传统中药材,研究发现其能促细胞有丝分裂,促进小鼠体内T淋巴细胞增殖的活性和提高机体免疫活性,抑制DNA聚合酶的活性,抑制Ras癌基因蛋白的翻译后修饰,促进细胞活素的生成等功效,促进细胞增殖和对细胞毒性低等特点,在动物细胞体外培养增殖方面开始得到关注。
本研究采用MTT法快速检测细胞增殖,筛选Gls提取物浓度并替代部分血清,用于评估Gls提取物对CHO细胞生长的作用效果。通过构建稳定表达绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)细胞株,并在旋转瓶中进行动态培养,考察Gls在促进细胞增殖的同时对蛋白表达量的影响。此外利用这种一种非侵入式的血清类似物高通量筛选平台,筛选了三种促进细胞生长的血清类似物生长因子,同时通过多种细胞系验证发现由大豆蛋白胨(soya peptone),维生素C(vitamin C,Vc)和还原型谷胱甘肽(Glutathione,GSH)组成的培养基,简称SVG培养基是一种广谱培养基。当Gls添加浓度为0.01%(w/v)时,CHO细胞在低血清(1%FBS)培养基中能够达到与正常培养基(10%FBS)一致的培养效果;同时通过血清饥饿诱导凋亡研究发现,Gls能够抑制血清饥饿诱导的细胞凋亡。
此外发现Gls中主要成分β-D-葡聚糖多糖对细胞增殖的影响与Gls提取物增殖促进效果一致。最后,通过旋转瓶扩增培养,CHO细胞在旋转瓶中动态培养60 h后,正常培养基中(10%FBS+DMEM)生长的CHO细胞扩增11.41倍,而1%FBS w 0.01%Gls培养基中生长的CHO细胞扩增倍数为10.29,与商业化的无血清(Serum Free,SF)培养基对照组扩增6.19倍相比,扩增倍数提高了66.38%。含有1%FBS的低血清培养基中加入适量Gls,与10%FBS普通培养基相比,CHO细胞的生长情况、细胞增殖数目、比生长速率和蛋白表达量几乎一致。
本研究建立了一种光学分析检测CHO细胞增殖的方法,主要包括四个步骤:(1)转化pEGFP-N2到大肠杆菌DH5α中及提取无内毒素的质粒;
(2) 采用脂质体法瞬时转染pEGFP-N2到CHO细胞中;
(3) 采用遗传霉素G418对转染的细胞进行抗性筛选;
(4)将稳定表达GFP的细胞株扩增培养,消化细胞并采用台盼蓝染色对细胞计数及采用酶标仪检测荧光强度,基于细胞内GFP荧光强度和细胞数目呈现线性关系,判断CHO细胞增殖情况,用于无血清培养基生长因子的高通量筛选,该方法具有易操作性、检测结果准确性、良好重复性、敏感度高和无毒等优势。
参考文献
[1]Identification of novel insulin mimetic drugs by quantitative total internal reflection fluorescence(TIRF)microscopy[J].Peter Lanzerstorfer;;Verena Stadlbauer;;Lilia A Chtcheglova;;Renate Haselgrübler;;Daniela Borgmann;;Jürgen Wruss;;Peter Hinterdorfer;;Klaus Schr?der;;Stephan M Winkler;;Otmar H?glinger;;Julian Weghuber.Br J Pharmacol,2014(23)
[2]Effect of Brazilian propolis(AF-08)on genotoxicity,cytotoxicity and clonogenic death of Chinese hamster ovary(CHO-K1)cells irradiated with 60 Co gamma-radiation[J].Geyza Spigoti Santos;;Shigetoshi Tsutsumi;;Daniel Perez Vieira;;Paolo Bartolini;;Kayo Okazaki.Mutation Research-Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis,2014
[3]Cell-based high-throughput proliferation and cytotoxicity assays for screening traditional Chinese herbal medicines[J].Ding Li;;Ru Zang;;Shang-Tian Yang;;Jufang Wang;;Xiaoning Wang.Process Biochemistry,2013
[4]Cell‐based screening of traditional chinese medicines for proliferation enhancers of mouse embryonic stem cells[J].Ding Li;;Sarah Isherwood;;Andrew Motz;;Ru Zang;;Shang‐Tian Yang;;Jufang Wang;;Xiaoning Wang.Biotechnol Progress,2013(3)
[5]钟启.灵芝孢子粉提取物对中国仓鼠卵巢细胞生长的影响及无血清生长因子筛选方法的构建[D].华南理工大学,2015.