背景[1-3]
人鼻咽癌细胞来源于一位58岁女性鼻咽癌患者，形态：上皮细胞样，多角形，短梭形，边缘不规则，单层贴壁生长，背景干净，不产色素，无空泡。
人鼻咽癌细胞
人鼻咽癌细胞培养步骤
一．人鼻咽癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备基础培养基(GIBCO，，添加NaHCO3 1.5g/L，丙酮酸钠0.11g/L)；优质胎牛血清，10%。
2）人鼻咽癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人鼻咽癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．人鼻咽癌细胞处理：
1）复苏人鼻咽癌细胞：将含有1mL人鼻咽癌细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有人鼻咽癌细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人鼻咽癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁人鼻咽癌细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗人鼻咽癌细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将人鼻咽癌细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人鼻咽癌细胞冻存：待人鼻咽癌细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。
应用[4][5]
人鼻咽癌细胞可以用于千金藤碱对人鼻咽癌细胞CNE-2和5-8F的作用及机制研究
研究千金藤碱是否能抑制人鼻咽癌CNE-2、5-8F细胞的生长,此作用是否有浓度、时间依赖性,并探索其作用机制。
方法:(1)采用细胞增殖及毒性检测试剂盒(CCK-8)检测千金藤碱对CNE-2、5-8F细胞的细胞毒性作用:不同浓度的千金藤碱(1.25mg/L、2.5mg/L、5mg/L、10mg/L、20mg/L)以不同时间(24h、48h、72h)作用于CNE-2和5-8F细胞后,用酶标仪测定吸光度,计算千金藤碱对细胞的抑制率,并制作抑制率曲线图;
(2) 采用流式细胞仪(FCM)检测CNE-2、5-8F细胞的细胞周期及凋亡率:根据CCK-8的实验结果选择适当的药物浓度,作用于CNE-2和5-8F细胞48h后,上机检测;
(3) 采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)法检测周期、凋亡相关蛋白的mRNA表达:根据CCK-8的实验结果,选择半数抑制浓度(IC50浓度)为中浓度,设置低、中、高三个浓度的千金藤碱处理组,分别作用于CNE-2、5-8F细胞24h、48h、72h后,检测三组中各基因的mRNA表达量;
(4) 采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测Bcl-2、Bax、Cyclin D1的蛋白表达量。
结果:(1)CCK-8检测结果表明:CNE-2细胞经千金藤碱作用24h、48h、72h后的半数抑制浓度(IC50值)分别为16.0737mg/L、9.8561mg/L、5.61277mg/L;5-8F经千金藤碱作用24h、48h、72h后的IC50分别为27.5491mg/L、19.5802mg/L、10.9068mg/L,各组间差异显著(P<0.05),并呈现时间和浓度依赖性;
(2) FCM周期检测结果:当药物浓度从0mg/L增加到20mg/L时,CNE-2的G2期细胞比例从0mg/L浓度时的14.20±0.23增加到20mg/L浓度时的64.86±0.29,5-8F的G2期细胞比例从0mg/L浓度时的10.31±1.25增加到20mg/L浓度时的53.90±1.43,相比对照组差异显著(P<0.01);FCM凋亡结果显示:随着药物浓度增加,CNE-2细胞凋亡率从0mg/L的6.26±0.33增加到20mg/L的39.79±1.78,相比对照组差异显著(P<0.01)。随着药物浓度增加,5-8F细胞凋亡率从0mg/L的5.12±0.30增加到20mg/L的33.07±0.72,相比对照组差异显著(P<0.01)。
(3) qRT-PCR法检测结果显示,在两株细胞中Bcl-2和Cyclin D1的mRNA表达量随着药物浓度增加及作用时间的延长而逐渐减少,Bax的mRNA表达量随着药物浓度增加及作用时间的延长而逐渐增加;
(4) Western blot法检测结果显示,两株细胞中Bcl-2和Cyclin D1的蛋白表达量随着药物浓度增加及作用时间延长而逐渐减少,Bax的蛋白表达量随着药物浓度增加及作用时间延长而逐渐增加。
结论:(1)千金藤碱对人鼻咽癌CNE-2和5-8F细胞有增殖抑制作用,能够阻滞细胞周期于G2期,并诱导CNE-2和5-8F细胞的凋亡;
(2)千金藤碱可能是通过下调CNE-2和5-8F细胞中Bcl-2和Cyclin D1的表达,上调Bax的表达影响细胞周期,并诱导凋亡。
参考文献
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[5]赵美淇.千金藤碱对人鼻咽癌细胞CNE-2和5-8F的作用及机制研究[D].广西医科大学,2019.