背景[1-3]
NIH3T3与原始的随机交配3T3和近交系BALB/c 3T3建株方法一样,NIH/3T3,是从NIH Swiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触抑制的连续细胞株。为了培育在形态学特征上更适合于进行转化分析的亚株,建立的NIH/3T3细胞株又进行了五轮以上亚克隆。这株细胞对DNA转化及转染研究十分有用。该细胞易于转染,对肉瘤病毒转化灶形成和白血病病毒增殖十分敏感。检测表明肢骨发育畸形病毒(鼠痘)阴性。
NIH3T3
NIH/3T3是从NIHSwiss小鼠胚胎培养物中建立的高度接触性抑制的连续传代细胞株。为了培育在形态学特征上更适合于进行转化分析的亚株,建立的NIH/3T3细胞株又进行了5轮以上亚克隆。该细胞株对肉瘤病毒的转化灶形成和白血病病毒的繁殖高度敏感,对DNA转化及转染研究十分有用。
NIH3T3细胞培养操作
1)复苏NIH3T3细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)NIH3T3细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)NIH3T3细胞冻存:待细胞生长状态良好时,可进行细胞冻存。下面T25瓶为类;
1.NIH3T3细胞冻存时,弃去培养基后,PBS清洗一遍后加入1ml胰酶,细胞变圆脱落后,加入1ml含血清的培养基终止消化,可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞,根据细胞数量加入血清和DMSO,轻轻混匀,DMSO终浓度为10%,细胞密度不低于1x106/ml,每支冻存管冻存1ml细胞悬液,注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中,放入-80度冰箱,2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
NIH3T3可以用于原花青素对TGF-β诱导NIH3T3细胞增殖及分化的影响
探讨原花青素对受TGF-β1诱导的NIH3T3细胞增殖及分化影响,并探讨其对PI3K/AKT通路的影响,为肺纤维化早期药物干预研究提供新思路及相关依据。
方法:将在体外培养的NIH3T3细胞(小鼠胚胎成纤维细胞,贴壁生长)作为研究对象,在体外适宜条件下培养,取对数生长的细胞接种在96孔板中待细胞贴壁后随机分为五组,A组(空白对照组)不加LY294002(PI3K抑制剂)、原花青素或TGF-β1药物;B组(TGF-β1组)仅仅加入5μg/L浓度的TGF-β1;C组(原花青素+TGF-β1组)先加入50μg/m L浓度的原花青素溶液预处理1h后,再加入TGF-β1(5μg/L);D组(LY294002+TGF-β1组)先加入10μmol/L浓度的LY294002作用1h后,再予以TGF-β1(5μg/L);E组(LY294002+原花青素+TGF-β1组)先加入LY294002(10μmol/L)作用1h,再加入原花青素(50μg/m L)作用1h,最后予以TGF-β1(5μg/L)。
以上五组经不同处理的NIH3T3细胞在条件适宜的普通细胞培养箱中培养24 h。分别于12、24、48 h点用CCK8法检测细胞增殖活力情况;观察记录五组细胞形态上的变化并检测各组细胞PI3K、AKT的m RNA表达情况以及α-SMA、Col-I、ρ-PI3K、ρ-AKT各蛋白的表达情况。
结果:1、细胞形态观察:倒置生物显微镜下可见A组为纺锤形或者星形的成纤维细胞,其余组可见扁平状结构的肌成纤维细胞,B组实验细胞在镜下较为明显。
2、CCK8检测结果:B组细胞增殖活力在12、24、48 h三个时间点均高于A组,C、D组细胞增殖活力在24、48 h两个时间点均高于A组但低于B组,E组细胞增殖活力在三个时间点均低于B组(差异具有统计学意义,P<0.05)。
3、WB结果示:加入药物的B、C、D、E四个实验组的α-SMA、Col-I的蛋白表达相比较于空白对照A组均有升高,C、D、E组此两种蛋白表达均较B组低,E组中α-SMA蛋白相比C、D组表达水平更低(差异具有统计学意义,P<0.05),C、D两组比较此两种蛋白表达水平无明显差异。加入药物的B、C、D、E四组实验组的ρ-PI3K、ρ-AKT的蛋白表达相比较于空白对照A组而言均有升高,四组实验组的蛋白表达水平由高到低依次为B组、C组、D组和E组(差异具有统计学意义,P<0.05)。
4、qRT-PCR结果显示:加入药物的B、C、D、E四组实验组的PI3K、AKT的m RNA表达相比较于空白对照A组而言均有升高,四组实验组的PI3K、AKT的m RNA表达水平由高到低依次为B组、C组、D组和E组(差异具有统计学意义,P<0.05)。
结论:原花青素可能通过下调TGF-β1-PI3K/AKT通路抑制NIH3T3细胞的增殖及分化。
参考文献
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[3]Grape Seed Proanthocyanidin Extract Ameliorates Cardiac Remodelling After Myocardial Infarction Through PI3K/AKT Pathway in Mice[J].Ruan Yongxue;Jin Qike;Zeng Jingjing;Ren Fangfang;Xie Zuoyi;Ji Kangting;Wu Lianpin;Wu Jingguo;Li Lei.Frontiers in Pharmacology,2020
[4]A Network Pharmacology Approach to Explore the Potential Mechanisms of Yifei Sanjie Formula in Treating Pulmonary Fibrosis[J].Qiao Bo;Wu Yueying;Li Xiaoya;Xu Zhenyuan;Duan Weigang;Hu Yanan;Jia Wenqing;Fan Qiuyang;Xing Haijing;Liu Suhuan.Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2020
[5]李江.原花青素对TGF-β诱导NIH3T3细胞增殖及分化的影响[D].南华大学,2021.