背景[1-3]
KP-N-NS源自一位男性脑转移灶的肾上腺神经母细胞瘤。
KP-N-NS
复苏KP-N-NS细胞步骤：
将含有1mLKP-N-NS细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
KP-N-NS细胞传代步骤：
如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3. 按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
KP-N-NS细胞冻存步骤：
待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
KP-N-NS可以用于NDRG1对人神经母细胞瘤化疗耐药性及耐药基因的作用
了解细胞内NDRG1基因表达增强对人神经母细胞瘤KP-N-Ns细胞株化疗耐药性及细胞耐药蛋白表达的影响,探讨可能的调控机制,为人神经母细胞瘤的生物治疗探索新的途径。
方法1.构建人NDRG1基因的慢病毒表达载体并检测目的基因的转染情况；
2. 实验分组：含NDRG1目的基因的慢病毒载体感染人神经母细胞瘤KP-N-Ns细胞株细胞建立稳定表达NDRG1的稳转株细胞为NDRG1组、空白载体感染细胞为阴性对照组(Negative control,NC、正常培养的神经母细胞瘤细胞为空白对照组(Blank);3建立稳定表达人NDRG1基因的神经母细胞瘤细胞株；
3. 分别用Northern-blot及Western-blot方法检测感染后细胞中NDRG1在基因水平及蛋白质水平的改变,以确定感染效率；
4. 用MTT法及Tunel法检测3组细胞对长春新碱、环磷酰胺、顺铂、替尼泊苷及盐酸表柔比星五种化疗药物的耐药性；
5. 用Western-blot法检测3组细胞中3种耐药基因MDR-1、LRP、MRP1蛋白表达变化。
结果1.构建的人NDRG1基因慢病毒表达载体经酶切后进行PCR扩增,证实有NDRG1基因成功转染,基因测序与人NDRG1序列相同,所获得的病毒滴度为4.3x105ifu/ml;
2. 所建立的稳转株细胞中目的基因NDRG1在mRNA水平和蛋白水平表达增加,提示稳转株细胞构建成功；
3. MTT检测结果示：在长春新碱、环磷酰胺、顺铂、替尼泊苷及盐酸表柔比星五种化疗药物的培养条件下,NDRG1转染组生长显著高于阴性对照组及空白对照组,阴性对照组及空白对照组之白无明显差异。TUNEL结果示：在长春新碱、顺铂、替尼泊苷及盐酸表柔比星四种化疗药物存在条件下,NDRG1转染组凋亡细胞明显少于阴性对照组和空白对照组,而阴性对照组与空白对照组之间凋亡无显著差异。提示NDRG1转染细胞对长春新碱、环磷酰胺、顺铂、替尼泊苷及盐酸表柔比星等五种化疗药物的耐药性增加。
4. NDRG1组中MDR-1、LRP,MRP1蛋白表达明显高于阴性对照组和空白对照组细胞。说明转染人NDRG1基因后,人神经母细胞瘤KP-N-Ns细胞株细胞MDR-1、LRP、MRP1基因表达产物增加。
慢病毒载体具有强感染能力,可有效地感染神经元细胞、肿瘤细胞等多种类型的细胞,是一个较理想的基因治疗工具。本实验中克隆人的NDRG1基因序列,经扩增后,构建慢病毒表达载体pLenti6.3-NDRGl-IRES-EGFP,表达载体与慢病毒包装质粒共转染人293T细胞进行目的基因的慢病毒包装,收获病毒颗粒,用于人神经母细胞瘤细胞的感染。在正常的生长条件下,NDRGl可抑制肿瘤细胞的凋亡,而在化疗药物存在的条件下,肿瘤细胞凋亡减少则表现为对化疗药物的耐药。
参考文献
[1]Expression of N-myc downstream regulated gene 1(NDRG1)in central neurocytoma[J].Abbas Fotovati;;Samah Abu-Ali;;Yasuo Sugita;;Yasuhiro Nakamura.Journal of Clinical Neuroscience,2011(10)
[2]Local control,survival,and operative morbidity and mortality after re-resection,and intraoperative radiation therapy for recurrent or persistent primary high-risk neuroblastoma[J].Barrie S.Rich;;Maureen P.McEvoy;;Michael P.LaQuaglia;;Suzanne L.Wolden.Journal of Pediatric Surgery,2011(1)
[3]Down-regulation of NDRG2 gene expression in human colorectal cancer involves promoter methylation and microRNA-650[J].Li Feng;;Yun Xie;;Hao Zhang;;Yunlin Wu.Biochemical and Biophysical Research Communications,2011(4)
[4]NDRG1 as a biomarker for metastasis,recurrence and of poor prognosis in hepatocellular carcinoma[J].Jun Cheng;;Hai-Yang Xie;;Xiao Xu;;Jian Wu;;Xuyong Wei;;Rong Su;;Wu Zhang;;Zhen Lv;;Shusen Zheng;;Lin Zhou.Cancer Letters,2011(1)
[5]张大.NDRG1对人神经母细胞瘤化疗耐药性及耐药基因的作用[D].郑州大学,2012.