背景[1-3]
人肺腺癌细胞源自一位病理切片确诊为混合型恶性肋膜间皮瘤的43岁患者的切除组织。SMC-l细胞的特征是多态性和多层生长，群体倍增时间约为32小时。最高的有丝分裂指数为46-50%，SMC-l细胞移植到动物中可以生成在组织学上与原发灶类似的肿瘤。
人肺腺癌细胞
一．人肺腺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备MCCOY'S 5A（推荐iCell-0011）培养基；优质胎牛血清，10%；双抗1%。
2）人肺腺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人肺腺癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．人肺腺癌细胞处理：
1）冻存人肺腺癌细胞的复苏：
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入到含4-6mL完全培养基的离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，完全培养基重悬细胞。然后将细胞悬液加入含6-8ml完全培养基的培养瓶（或皿）中37℃培养过夜。第二天显微镜下观察细胞生长情况和细胞密度。
2）人肺腺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁人肺腺癌细胞传代可以参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加入0.25％（w/v）胰蛋白酶-0.53 mM EDTA于培养瓶中（T25瓶1-2mL，T75瓶2-3mL），置于37℃培养箱中消化1-2分钟（难消化的细胞可以适当延长消化时间），然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3-4ml含10%FBS的培养基来终止消化。
3.轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心3-5min，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。将细胞悬液按1：2的比例分到新T25瓶中，添加6-8ml按照说明书要求配置的新的完全培养基以保持细胞的生长活力，后续传代根据实际情况按1:2~1:5的比例进行。
3）人肺腺癌细胞冻存:收到细胞后建议在培养前3代时冻存一批细胞种子以备后续实验使用。
下面T25瓶为例；
1.细胞冻存时按照细胞传代的过程收集消化好的细胞到离心管中，可使用血球计数板计数，来决定细胞的冻存密度。一般细胞的推荐冻存密度为1×10^6~1×107个活细胞/ml.
2.1000rpm离心3-5min，去掉上清。用配制好的细胞冻存液重悬细胞，按每1ml冻存液含1×10^6~1×107个活细胞/ml分配到一个冻存管中将细胞分配到冻存管中，标注好名称、代数、日期等信息。
3.将要冻存的细胞置于程序降温盒中，-80度冰箱中过夜，之后转入液氮容器中储存。
应用[4][5]
人肺腺癌细胞可以用于苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响
观察不同浓度苯噻啶(Pizotifen)对人肺腺癌A549和PC9细胞的增殖、迁移与侵袭能力的影响,并初步探究其机制。
方法：传代培养人肺腺癌A549和PC9细胞,取对数生长期的细胞,将其分为对照组(细胞对照组为培养基直接作用于细胞、溶剂对照组为含有0.1%二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide,DMSO)的培养基作用于细胞)和实验组(浓度为10、20、30、40μmol/L的苯噻啶作用于细胞)。不同浓度苯噻啶作用24h和48h后采用CCK-8法检测人肺腺癌细胞的增殖能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用划痕实验和Transwell迁移实验检测人肺腺癌细胞的迁移能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用Transwell侵袭实验检测人肺腺癌细胞的侵袭能力;不同浓度苯噻啶作用24h后采用ELISA法检测人肺腺癌细胞中Wnt3a/β-catenin信号通路蛋白、上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白E-钙粘蛋白(E-cadherin,E-cad)和基质金属蛋白酶-9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)的表达水平。比较并分析上述各实验指标的组间差异。
结果各实验组检测指标与溶剂对照组相比:(1)CCK8法检测显示,实验组A549和PC9细胞活力降低,各组抑制细胞增殖的程度不一致;在相同作用时间(24h或48h)下,伴随苯噻啶浓度升高,实验组A549和PC9细胞活力越来越低,组间差异有统计学意义(24h(A549:F=210.7,P<0.05;PC9:F=177.2,P<0.05)和48 h(A549:F=132.3,P<0.05;PC9:F=631.3,P<0.05));在相同作用浓度(20、30、40μmol/L)下,苯噻啶作用48h对细胞活力的抑制作用高于24h,差异有统计学意义(P<0.05)。
(2) 划痕实验结果表明,苯噻啶作用24h后实验组划痕愈合率均低于溶剂对照组,苯噻啶浓度越高,划痕愈合率越低,差异具有统计学意义(A549:F=868.9,P<0.05;PC9:F=921.0,P<0.05)。
(3) Transwell迁移实验结果显示,苯噻啶作用24h后实验组迁移至小室下的细胞数量均低于溶剂对照组,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(A549:F=474.2,P<0.05;PC9:F=784.6,P<0.05)。
(4) Transwell侵袭实验结果表明,苯噻啶作用24h后与溶剂对照组相比,实验组侵袭至小室下的肺腺癌细胞数量明显降低,具有浓度依赖性,差异有统计学意义(A549:F=354.0,P<0.05;PC9:F=193.2,P<0.05)。
(5)ELISA结果显示,苯噻啶作用24h后与溶剂对照组相比,实验组细胞中Wnt3a(A549:F=534.62,P<0.05;PC9:F=534.08,P<0.05)、β-catenin(A549:F=124.51,P<0.05;PC9:F=212.22,P<0.05)和MMP-9(A549:F=215.96,P<0.05;PC9:F=355.48,P<0.05)蛋白浓度均显著降低,差异有统计学意义,且伴随苯噻啶浓度升高,Wnt3a、β-catenin和MMP-9蛋白浓度越来越低;作用24h后与溶剂对照组相比,实验组细胞中E-cad蛋白浓度大大增高,差异有统计学意义(A549:F=224.98,P<0.05;PC9:F=534.08,P<0.05),伴随苯噻啶浓度升高,E-cad浓度也更高。
参考文献
[1]MiR-4429 Alleviates Malignant Behaviors of Lung Adenocarcioma Through Wnt/β-Catenin Pathway.[J].Zhou Shaoqiang;Qian Kebao;Yu Shuhui;Zhao Yutao;Shen Qin;Li Ya.Cancer biotherapy&radiopharmaceuticals,2021
[2]Serotonin Pathway in Cancer[J].Balakrishna Pragathi;George Sagila;Hatoum Hassan;Mukherjee Sarbajit.International Journal of Molecular Sciences,2021(3)
[3]Role of serotonin receptor signaling in cancer cells and anti-tumor immunity.[J].Karmakar Surojit;Lal Girdhari.Theranostics,2021(11)
[4]Treatment patterns and medication adherence among newly diagnosed patients with migraine:a drug utilisation study[J].Orlando Valentina;Mucherino Sara;Monetti Valeria Marina;Trama Ugo;Menditto Enrica.BMJ Open,2020(11)
[5]郑江霞.苯噻啶对人肺腺癌细胞增殖、迁移与侵袭能力的影响[D].安徽医科大学,2022.