背景[1-3]
HEP-G2细胞系人肝癌细胞来源于一名15岁的白人少年的肝癌组织。该细胞表达甲胎蛋白、白蛋白、α-2-巨球蛋白、α-1-抗胰蛋白酶、转铁蛋白、α-1-抗凝乳蛋白酶、结合珠蛋白、铜蓝蛋白、纤溶酶原、补体C4、C3激活物、纤维蛋白原、α-1酸性糖蛋白、α-2-HS-糖蛋白、β-脂蛋白、视黄醇结合蛋白；表达胰岛素受体和胰岛素样生长因子IGFⅡ的受体；该细胞具有3-羟基-3-甲酰辅酶A还原酶和肝甘油三酯脂肪酶的活性。目前尚未证明该细胞中有HBV基因组。
HEP-G2细胞系
HEP-G2细胞系人肝癌细胞培养步骤
一、培养基及培养冻存条件准备：
1、准备MEM培养基；北美胎牛血清，10%；双抗，1%。
2、HEP-G2细胞系人肝癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3、HEP-G2细胞系人肝癌细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二、HEP-G2细胞系人肝癌细胞细胞处理：
1、复苏HEP-G2细胞系人肝癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2、HEP-G2细胞系人肝癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2、加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mMEDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4、收到细胞后传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。
HEP-G2细胞系人肝癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
1、细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml*培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2、1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。本公司按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3、将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
HEP-G2细胞系人肝癌细胞可以用于苦参碱通过mTOR信号通路诱导人肝癌Hep G2细胞发生自噬现象
探讨苦参碱(Matrine,Mat)诱导人肝癌Hep G2细胞发生自噬现象的分子机制。
方法：以人肝癌Hep G2细胞为研究对象,不同浓度苦参碱(0,0.25,0.5,1.0,2.0mg/ml)干预12h,24h,48h后,用倒置显微镜观察Hep G2细胞的形态学变化,透射电子显微镜观察细胞超微结构的变化,实时定量RT-PCR检测Beclin 1 mRNA的表达水平,Western blotting方法检测自噬相关蛋白LC3-Ⅱ,雷帕霉素靶蛋白(mTOR/p-mTOR)及其下游的核糖体蛋白质S6(p70s6k/p-p70s6k)蛋白的表达。
结果：0,0.25,0.5,1.0,2.0 mg/ml苦参碱作用12h,24h,48h后,以时间和剂量依赖的方式诱导人肝癌Hep G2细胞发生自噬现象。倒置相差显微镜下发现对照组(0 mg/ml苦参碱)细胞生长良好,形态正常,贴壁完整,苦参碱组细胞胞质中出现了大小不等的空泡,并不断增多、变大。1.0和2.0mg/ml的苦参碱作用12,24,48h后,培养基中出现不能贴壁的悬浮细胞,细胞变小、变圆。2.0 mg/ml的苦参碱作用48h后,整个培养基在镜下呈一片荒凉状。透射电子显微镜下进一步证实1.0mg/ml苦参碱干预24h后,与对照组(0mg/ml苦参碱)相比,苦参碱处理组细胞可见肿胀的细胞器,双层膜结构包裹的细胞质,以及明显的自噬小泡和空泡。
实时定量RT-PCR和Western blotting检测显示苦参碱作用人肝癌Hep G2细胞后,以时间和剂量依赖方式上调自噬现象发生过程中必不可少的基因Beclin 1的mRNA及自噬现象发生的分子标志LC3-Ⅱ蛋白的表达。
Western blotting检测同时显示苦参碱诱导人肝癌Hep G2细胞发生的自噬现象可能是通过mTOR信号通路实现。苦参碱干预24h后,mTOR及其下游p-70s6k蛋白的表达没有明显的统计学差异(p>0.05)；0,0.25,1.0,2.0mg/ml的苦参碱作用24h后,p-mTOR及p-p70s6k蛋白的表达量随着苦参碱浓度的增加而下调。
结论：苦参碱能够以时间和剂量依赖性的方式诱导人肝癌Hep G2细胞发生自噬现象,并且这种自噬现象的诱导可能通过下调mTOR信号通路实现。
参考文献
[1]Caffeine induces apoptosis by enhancement of autophagy via PI3K/Akt/mTOR/p70S6K inhibition[J].Shinji Saiki;;Yukiko Sasazawa;;Yoko Imamichi;;Sumihiro Kawajiri;;Takahiro Fujimaki;;Isei Tanida;;Hiroki Kobayashi;;Fumiaki Sato;;Shigeto Sato;;Ken-Ichi Ishikawa;;Masaya Imoto;;Nobutaka Hattori.Autophagy,2011(2)
[2]mTOR/p70S6K Signal transduction pathway contributes to osteosarcoma progression and patients’prognosis[J].Quan Zhou;;Zhansheng Deng;;Yong Zhu;;Haitao Long;;Shaoxian Zhang;;Jiali Zhao.Medical Oncology,2010(4)
[3]Beclin 1 and LC3 autophagic gene expression in cutaneous melanocytic lesions[J].Clelia Miracco;;Gabriele Cevenini;;Alessandro Franchi;;Pietro Luzi;;Elena Cosci;;Vasileios Mourmouras;;Irene Monciatti;;Susanna Mannucci;;Maurizio Biagioli;;Marzia Toscano;;Daniele Moretti;;Roberto Lio;;Daniela Massi.Human Pathology,2010(4)
[4]Ethionine-Induced ATP Depletion Represses mTOR Signaling in the Absence of Increases in AMP-Activated Protein Kinase Activity in the Rat Liver[J].Fumiaki YOSHIZAWA;;Shinji MOCHIZUKI;;Masako DOI;;Ippei YAMAOKA;;Kunio SUGAHARA.Bioscience,Biotechnology,and Biochemistry,2009(9)
[5]任志俭.苦参碱通过mTOR信号通路诱导人肝癌Hep G2细胞发生自噬现象[D].兰州大学,2011.