背景[1-3]
NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系是1986年4月建株的，该患者吸烟。每年15包。ATCC CRL-5957是一株来源于同一患者的类淋巴母细胞。
NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系
NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系培养操作:
1）复苏NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
NCI-H1395人非小细胞肺癌贴壁细胞系可以用于硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究
检测了人肺腺癌组织和相邻癌旁组织中内源性硫化氢合成酶的表达情况。实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和western blot实验结果显示,30对肺腺癌组织临床样本中3种硫化氢合成酶CBS、CSE和MPST的表达量显著高于癌旁组织。其中,CBS和CSE的表达水平与肺腺癌肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移程度有明显相关性,而MPST的表达水平主要与肿瘤大小有关。体外结果同样表明,肺腺癌A549、95D和NCI-H1395细胞中硫化氢合成酶以及H2S含量明显高于正常肺上皮BEAS-2B细胞。
本文选择H2S含量最多的A549细胞系进行后续实验。其次,以硫氢化钠(NaHS)作为H2S供体,通过MTT实验检测NaHS对A549细胞的作用。实验结果表明,低浓度的外源NaHS(0-50μM)可促进A549细胞增殖,而2000μM浓度的NaHS则显著促进A549细胞凋亡。选取与H2S在体内含量近似的50μM NaHS作为实验浓度刺激A549细胞24小时。结果显示,该浓度可显著促进A549细胞增殖、迁移和侵袭,加快肿瘤上皮间质转化(EMT)过程。采用化学抑制剂和小干扰RNA(siRNA)基因沉默手段分别对肺腺癌中主要产生H2S的CBS和CSE进行抑制。
结果表明,化学抑制剂氨基氧乙酸(AOAA)和DL-炔丙基甘氨酸(PAG)都能显著抑制细胞增殖,并将细胞周期阻滞在G2/M期,促进细胞凋亡;同时抑制细胞划痕愈合、transwell侵袭及EMT过程。上述结果在siRNA基因沉默实验中得到进一步验证。此外,H2S作为无机电子供体可促进A549细胞能量代谢过程,提高线粒体膜电位,加速ATP的产生和糖酵解过程。AOAA和PAG分别抑制CBS和CSE酶活性后,线粒体膜电位下降,进而抑制A549细胞内ATP的生成以及葡萄糖分解和转化过程。再次,western blot实验结果显示,H2S可在肿瘤缺氧微环境中增加缺氧诱导因子-1α(HIF-1α)的表达量。
免疫荧光实验结果表明,H2S可增加HIF-1α积累,促进HIF-1α进入细胞核的过程。进一步采用双荧光素酶报告基因检测H2S对HIF-1α的转录活性的影响。结果显示,在氯化钴(CoCl2)模拟化学缺氧微环境条件下,H2S可提高HIF-1α的转录活性,而AOAA和PAG作用后可明显抑制A549细胞中HIF-1α转录活性。缺氧诱导的HIF-1α表达增加可促进A549细胞中硫化氢合成酶的表达量,进而提高胞内H2S含量。HIF-1α抑制剂2-MeOE2和siRNA基因沉默HIF-1α均能显著抑制缺氧条件下A549细胞中CBS和CSE的表达,进而抑制H2S的产量。因此,H2S和HIF-1α之间存在正反馈调控作用。同时,外源NaHS通过提高内源硫化氢合成酶的表达量进一步提升内源H2S的产量。
最后,体外小管生成实验结果表明,H2S可协同HIF-1α通过PI3K/AKT信号通路,上调血管内皮生成因子(VEGF)的表达,促进A549细胞血管生成。AOAA和PAG作用显著减少了VEGF表达,抑制了人脐静脉内皮HUVEC细胞增殖、迁移和小管的形成。裸鼠成瘤实验也显示AOAA和PAG可以抑制移植瘤的生长和血管生成过程。综上所述,H2S可促进A549细胞增殖、迁移以及EMT过程,同时增加HIF-1α的转录活性。而肿瘤缺氧微环境可促进A549细胞中H2S生成,形成H2S与HIF-1α的正反馈调控通路。
H2S协同HIF-1α上调VEGF表达,促进肺腺癌血管生成过程。本研究结果表明,H2S在肺腺癌中发挥促癌作用,抑制硫化氢合成酶可有效抑制肺腺癌肿瘤的增殖过程。本论文为H2S在肺腺癌中的研究提供了基础,为肺腺癌的预防、诊断以及靶向治疗提供新思路。
参考文献
[1]Epidemiology of lung cancer in China[J].Maomao Cao;;Wanqing Chen.Thoracic Cancer,2019(1)
[2]TGF‐β‐mediated exosomal lnc‐MMP2‐2 regulates migration and invasion of lung cancer cells to the vasculature by promoting MMP2 expression[J].Dong‐ming Wu;;Shi‐hua Deng;;Teng Liu;;Rong Han;;Ting Zhang;;Ying Xu.Cancer Medicine,2018(10)
[3]Anticancer effect of exogenous hydrogen sulfide in cisplatin?resistantA549/DDP cells[J].Ying Ma;;Zhonghai Yan;;Xiaomei Deng;;Junqi Guo;;Jinxia Hu;;Yuan Yu;;Fei Jiao.Oncology Reports,2018(6)
[4]Exogenous hydrogen sulfide promotes hepatocellular carcinoma cell growthby activating the STAT3-COX-2 signaling pathway[J].Yulan Zhen;;Qiaomei Wu;;Yiqian Ding;;Wei Zhang;;Yuansheng Zhai;;Xiaoxiong Lin;;Yunxia Weng;;Ruixian Guo;;Ying Zhang;;Jianqiang Feng;;Yiyan Lei;;Jingfu Chen.Oncology Letters,2018(5)
[5]王明琦.硫化氢调控人肺腺癌细胞增殖、迁移及血管生成机制的研究[D].吉林大学,2020.