背景[1-3]
人脑神经母细胞瘤细胞分离自低分化胚胎性神经母细胞瘤患儿的骨髓转移。神经母细胞瘤是由身体多个部位的未成熟神经细胞发展而来的一种恶性肿瘤。发病率并不高，但是婴儿最常见的肿瘤，也常见于儿童。神经母细胞瘤始于成神经细胞，大多数情况下，成神经细胞会随着婴儿神经系统的成熟而发育为神经细胞。
但是在患病的婴儿中，突变的成神经细胞无法正常成熟，而是不断生长分裂，最终导致神经母细胞瘤。神经母细胞瘤的体征和症状因起源部位的不同，而呈现不同。常见的症状包括有腹胀、腹痛、便秘或腹泻、呕吐、厌食、体重减轻、呼吸困难、疲劳和骨痛等。
人脑神经母细胞瘤细胞
人脑神经母细胞瘤细胞培养操作:
1)复苏人脑神经母细胞瘤细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)人脑神经母细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3)人脑神经母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人脑神经母细胞瘤细胞可以用于circHIPK3调控miR-653-5p/RSF1轴对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响
神经母细胞瘤(Neuroblastoma,NB)是小儿常见的一种恶性实体肿瘤,号称“儿童恶性肿瘤之王”,难治和复发依旧是治疗NB时的挑战。环状同源域相互作用蛋白激酶3(circular homeodomain interacting protein kinase 3,circHIPK3)在许多肿瘤的进展中都起到了关键的作用,但其在NB中的作用尚不明确。
本研究意在探讨circHIPK3在神经母细胞瘤中的表达及作用机制。研究方法通过二代测序法筛选出NB组织中具有表达差异的环状RNA;使用实时荧光定量PCR法(RT-q PCR)验证circHIPK3、miR-653-5p和RSF1在NB组织与人NB细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH、SK-N-BE(2),IMR-32和人胚肾细胞系HEK-293中的表达;分别向NB细胞系SH-SY5Y和SK-N-SH中转染小干扰RNA si-NC和si-circHIPK3或慢病毒敲降载体sh-NC和sh-circHIPK3;使用CCK-8和平板克隆形成实验验证circHIPK3在NB细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH增殖中的作用;使用划痕实验、Transwell实验检测circHIPK3对NB细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH迁移和侵袭的能力变化;使用Western blot检测NB细胞系SH-SY5Y、SK-N-SH中上皮间质转化(EMT)相关蛋白的表达;通过裸鼠皮下成瘤实验探讨circHIPK3在体内对NB的影响;生物信息学方法预测circHIPK3的下游调控靶标,并用荧光素酶报告基因实验验证二者之间的靶向调控关系;向稳定敲低circHIPK3的NB细胞系中转染miR-653-5p抑制物,利用CCK-8和Transwell实验等方法探究miR-653-5p与NB细胞增殖、迁移和侵袭能力的联系。
结果:CircHIPK3和RSF1在NB细胞和组织中高表达,miR-653-5p在NB细胞和组织中低表达。分别向SH-SY5Y细胞和SK-N-SH细胞中转染sh-circHIPK3后,细胞中circHIPK3的表达量下降。CCK-8、平板克隆形成实验、划痕实验及Transwell实验等实验结果都证实,随着circHIPK3的逐步敲低,NB细胞的生长、转移和侵袭能力都有所下降;Western blot结果表明在抑制circHIPK3表达时,N-钙黏蛋白和波状蛋白的表达减少,E-钙黏蛋白表达反而增加。
裸鼠皮下成瘤实验结果表明敲低circHIPK3的表达可以抑制NB在体内的生长。荧光素酶报告基因实验数据证明了在circHIPK3与miR-653-5p之间、miR-653-5p与RSF1(Remodeling and Spacing Factor1)之间有靶向调控位点。细胞功能回复实验结果证实circHIPK3通过调控miR-653-5p/RSF1轴从而影响NB细胞的恶性表型。结论circHIPK3在NB细胞和组织中高度表达,沉默了circHIPK3的表达能够抑制NB细胞的增殖、迁移、侵袭能力和EMT,同时也抑制NB细胞在体内的生长;进一步研究表明,circHIPK3通过调节miR-653-5p/RSF1轴影响NB细胞的生长、转移和侵袭。
意义：敲低circHIPK3的表达能够抑制NB细胞的恶性表型及NB细胞在体内的生长,所以circHIPK3可能是治疗NB药物的一个新的切入点,给抗NB药物的研发提供一个全新的思路。
参考文献
[1]CircRNA_0078767 promotes osteosarcoma progression by increasing CDK14 expression through sponging microRNA-330-3p.Zhang Guofeng;Zhu Yonglin;Jin Chengzhen;Shi Qingpeng;An Xiaochun;Song Licheng;Gao Fengguang;Li Shanhui.Chemico-Biological Interactions,2022
[2]Circular RNA_ANKIB1 accelerates chemo-resistance of osteosarcoma via binding microRNA-26b-5p and modulating enhancer of zeste homolog 2..Tang JinShan;Duan Gang;Wang YunQing;Wang Bin;Li WenBo;Zhu ZiQiang.Bioengineered,2022
[3]Silencing of circ-CDK14 suppresses osteosarcoma progression through the miR-198/E2F2 axis.Liu Jun;Zhao Jianwen;Feng Guang;Li Rui;Jiao Jianhang.Experimental Cell Research,2022
[4]Circular RNA circHIPK3 modulates prostate cancer progression via targeting miR-448/MTDH signaling.D.C.Liu;L.L.Song;X.Z.Li;Q.Liang;Z.G.Zhang;C.H.Han.Clinical and Translational Oncology,2021
[5]尉嘉斌.circHIPK3调控miR-653-5p/RSF1轴对神经母细胞瘤细胞增殖、迁移和侵袭的影响[D].青岛大学,2022.