背景[1-3]
人涎腺腺样囊性癌细胞源自一位28岁男性腺样囊性癌患者，人腭部小涎腺腺样囊性癌组织小块静置培养7天细胞开始生长，首次传代50天，BALB/C,CBA,Swiss，DF裸小鼠皮下移植成瘤，表达角蛋白。STR检测发现该细胞被HeLa细胞污染。
人涎腺腺样囊性癌细胞
人涎腺腺样囊性癌细胞培养操作:
1)复苏人涎腺腺样囊性癌细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)人涎腺腺样囊性癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养
3)人涎腺腺样囊性癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人涎腺腺样囊性癌细胞可以用于沉默UBE3A基因表达对涎腺腺样囊性癌细胞生物学行为的影响
UBE3A在SACC中的表达显著高于正常的涎腺组织,因此UBE3A能否成为SACC基因治疗的潜在靶点值得进一步探究。
目的:(1)通过对比UBE3A沉默前后SACC-LM细胞侵袭及迁移能力的改变,探索UBE3A对SACC细胞侵袭及迁移能力的影响。
(2) 通过对比UBE3A沉默前后SACC-LM细胞增殖和凋亡结果的差异,探究UBE3A是否参与SACC细胞的增殖和凋亡过程。
(3) 通过检测并对比UBE3A沉默前后SACC-LM细胞中VEGF和抑癌基因p53、PTEN蛋白表达水平的改变,探究UBE3A影响SACC生物学行为的可能机制,为研究泛素化在SACC中的功能及其机制奠定基础。
方法:构建沉默UBE3A表达的重组慢病毒并稳定转染至SACC-LM细胞中,采用实时荧光定量PCR(Real-time quantative PCR,RT-q PCR)检测细胞m RNA中UBE3A表达水平,筛选沉默效率最高的组别设置为后续研究的实验组,同时采用蛋白质印迹法(western blot,WB)进一步验证其沉默效果。利用Transwell小室法、细胞划痕愈合实验、CCK-8法及流式细胞术等方法分别检测细胞的侵袭、迁移、增殖和凋亡情况,同时通过WB实验技术了解细胞中VEGF、p53及PTEN蛋白的表达情况,最后根据实验结果对比分析,揭示沉默UBE3A表达对SACC生物学行为影响的作用机制,为UBE3A成为SACC的有效治疗靶点提供理论依据。
结果:Transwell小室法、细胞划痕愈合实验及CCK-8法的实验结果分别表明沉默UBE3A的表达可抑制SACC细胞的侵袭、迁移和增殖能力;流式细胞术检测结果显示沉默UBE3A的表达后SACC细胞的凋亡增多;WB实验结果表明UBE3A的表达下调后p53及PTEN蛋白的表达水平将上调,VEGF的表达受到了抑制。
结论:UBE3A在涎腺组织中的过表达可能参与了SACC的发生,从而在肿瘤的发展过程中促进了肿瘤细胞的迁移、侵袭、增殖及抗凋亡能力,因此通过抑制UBE3A的表达阻止SACC的发生及发展可能是潜在的治疗方法之一。
参考文献
[1]Dll4/Notch1 signalling pathway is required in collective invasion of salivary adenoid cystic carcinoma.Wang Ke;Fan Hua‑Yang;Pang Xing;Zhang Mei;Yu Xiang‑Hua;Wu Jia‑Shun;Chen Bing‑Jun;Jiang Jian;Liang Xin‑Hua;Tang Ya‑Ling.Oncology Reports,2021
[2]CASC9 plays a role in salivary adenoid cystic carcinoma in vitro by upregulation of ACLY..Xie Hongliang;Tang Jianming;Lu Lu;Li Bohan;Wang Mengmeng.Oral diseases,2020
[3]Fatty acid synthase contributes to epithelial-mesenchymal transition and invasion of salivary adenoid cystic carcinoma through PRRX1/Wnt/β-catenin pathway..Zhang Wei Long;Wang Sha Sha;Jiang Ya Ping;Liu Yan;Yu Xiang Hua;Wu Jing Biao;Wang Ke;Pang Xin;Liao Peng;Liang Xin Hua;Tang Ya Ling.Journal of cellular and molecular medicine,2020
[4]Expression of inhibitors of apoptosis proteins in salivary gland adenoid cystic carcinoma:XIAP is an independent marker of impaired cause-specific survival..Schnoell Julia;;Kadletz Lorenz;;Jank Bernhard J;;Oberndorfer Felicitas;;Brkic Faris F;;Gurnhofer Elisabeth;;Cede Julia;;Seemann Rudolf;;Kenner Lukas;;Heiduschka Gregor.Clinical otolaryngology:official journal of ENT-UK;official journal of Netherlands Society for Oto-Rhino-Laryngology&Cervico-Facial Surgery,2020
[5]罗建峰.沉默UBE3A基因表达对涎腺腺样囊性癌细胞生物学行为的影响[D].电子科技大学,2022.