背景[1-3]
人胚肾上皮包装细胞是在293细胞株上插入免疫缺陷病毒SV40 T-抗原基因后产生的高转染效率衍生株，广泛用于包装慢病毒，其转染效率比293细胞高很多，是研究基因功能的一个强大工具。
人胚肾上皮包装细胞
人胚肾上皮包装细胞培养操作规程：
一．人胚肾上皮包装细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO，货号11965-092)，90%；胎牛血清，10%。
2）人胚肾上皮包装细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）人胚肾上皮包装细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．人胚肾上皮包装细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）人胚肾上皮包装细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。
3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。
4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。
3）人胚肾上皮包装细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。
应用[4][5]
人胚肾上皮包装细胞可以用于NF-κB转录因子报告基因系统的构建优化及在筛选促TRAIL抗肿瘤药物中的应用
从抑制TRAIL激活的促存活信号通路NF-κB角度着手,尝试增强TRAIL抗肿瘤的活性。
分为以下四个部分:1)NF-κB转录因子报告基因系统的构建及优化;
2) 利用该系统筛选能下调NF-κB表达量或抑制NF-κB活性的中药成分;
3) 将2)中筛选出的中药成分与TRAIL联用,检测其对A549、COLO205等肿瘤细胞的杀伤效果;
4) 对3)中中药成分促进TRAIL抗肿瘤活性机制进行初步探索。
研究方法与结果:1.稳定表达NF-κB转录因子荧光素酶报告基因系统的构建及验证。
利用分子克隆的酶切、连接等基本操作,先将逆转录病毒载体pQCXIP原有的CMV启动子去除,再分别插入NF-κB增强子序列以及荧光素酶NanoLuc(NLuc)报告基因序列,构建了受转录因子NF-κB调控的荧光素酶NLuc报告基因表达载体pQCXIP-NF-κB-NLuc。将构建的pQCXIP-NF-κB-NLuc质粒与病毒包装质粒pVSVG一起用阳离子脂质体法转染人胚肾上皮包装细胞GP2-293细胞系制备相应的逆转录病毒,侵染人宫颈癌细胞系HeLa,通过嘌呤霉素筛选出表达相应抗性基因的阳性细胞,并进一步筛选出对NF-κB通路阳性刺激物TNFα最敏感的细胞克隆。该细胞株对TNFα的刺激呈现出浓度梯度、时间依赖性,表明受NF-κB转录因子调控的稳定表达NLuc荧光素酶的细胞系PP-NF-κB-NLuc-HeLa构建成功,可用于定量检测NF-κB的活化效果及筛选与NF-κB活化调控相关的药物等。
2.优化构建的荧光素酶报告基因系统检测方式。
在上述构建好的荧光素酶报告基因系统的应用过程中发现培养基的pH、培养基中的血清对NLuc荧光素酶的检测有影响,对于后续药物调控功能的检测存在不利影响,因此在初步确定了pH及血清的原因后,选取了NLuc荧光素酶发光强度较强及相对稳定的添加0.03%(V/V)Triton X-100的PBS缓冲液(PBST)作为Nluc酶的检测体系。
3. 筛选下调NF-κB的中药成分。在成功完成了系统的构建及NLuc荧光素酶的检测体系优化后,利用该系统对36种中药粗提物或单体进行了检测,并初步筛选出了12种能降低NF-κB活性或下调NF-κB表达量的中药粗提物或单体,在排除了有强细胞毒性的、有相关与TRAIL联用抗肿瘤报道的、促肿瘤增殖的成分等之后,最终选取了QD6-4、SKN两种中药单体进一步研究其与TRAIL的联用的效果。
4.筛选到的中药单体与TRAIL联用对肿瘤的杀伤检测。细胞活力检测实验结果表明,两种单体分别与TRAIL联用作用于人肺癌细胞系A549及结直肠癌细胞系COLO205细胞后,QD6-4对这两个细胞系几乎无任何促进TRAIL抗肿瘤活性的作用,SKN对COLO205几乎无作用,但能显著增强TRAIL对A549的杀伤,且在SKN使用浓度为2-8μM时有协同效果。进一步的实验结果表明,SKN对人结直肠癌细胞系HCT116、人宫颈癌细胞系HeLa、人胰腺癌细胞系PANC-1细胞系也均表现出了促进TRAIL杀伤的效果,其中在使用浓度为2-8μM时对HeLa和PANC-1细胞的杀伤作用均表现出了协同效果,且对PANC-1细胞系的协同效果尤为明显。
参考文献
[1]ay 61-3606 Sensitizes TRAIL-Induced Apoptosis by Downregulating Mcl-1 in Breast Cancer Cells..So-Young Kim;;Sang Eun Park;;Sang-Mi Shim;;Sojung Park;;Kyung Kon Kim;;Seong-Yun Jeong;;Eun Kyung Choi;;Jung Jin Hwang;;Dong-Hoon Jin;;Christopher Doosoon Chung;;Inki Kim.PLoS ONE,2017
[2]Shikonin induces mitochondria-mediated apoptosis and enhances chemotherapeutic sensitivity of gastric cancer through reactive oxygen species..Liang Wenquan;;Cai Aizhen;;Chen Guozhu;;Xi Hongqing;;Wu Xiaosong;;Cui Jianxin;;Zhang Kecheng;;Zhao Xudong;;Yu Jiyun;;Wei Bo;;Chen Lin.Scientific reports,2016
[3]Goniothalamin enhances TRAIL-induced apoptosis in colorectal cancer cells through DR5 upregulation and cFLIP downregulation..Sophonnithiprasert Thanet;;Nilwarangkoon Sirinun;;Nakamura Yukio;;Watanapokasin Ramida.International journal of oncology,2015
[4]Bcl-xL inhibition by molecular-targeting drugs sensitizes human pancreatic cancer cells to TRAIL..Hari Yoko;;Harashima Nanae;;Tajima Yoshitsugu;;Harada Mamoru.Oncotarget,2015
[5]郭志兰.NF-κB转录因子报告基因系统的构建优化及在筛选促TRAIL抗肿瘤药物中的应用[D].北京中医药大学,2017.