背景[1-3]
HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞是一种人口腔鳞癌细胞，HIV-1、HBV、HCV、支原体、细菌、酵母和真菌检测阴性。可以用于研究口腔鳞癌的发生、发展和治疗等方面研究。
HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞
HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞培养操作规程：
一．HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备DMEM培养基(DMEM，GIBCO)，95%；优质胎牛血清，5%，添加0.1U/ml胰岛素。
2）大鼠回肠细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）大鼠回肠细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加入3ml此细胞的培养基终止消化。
3.轻轻吹打后吸出，移入15ml离心管中，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养液后吹匀。
4.移入到事先准备好的含有5ml培养基的T-25培养瓶中或含有14ml培养基的T-75培养瓶中培养。
3）HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，先要消化处理并进行细胞计数。消化方法按照细胞传代方法的1-3步骤进行，最后的重悬液使用血清。悬浮细胞直接计数后离心，用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中。
应用[4][5]
HSC-6细胞系|人口腔鳞癌细胞可以用于PGRN对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响
近期在PGRN对肿瘤的作用研究方面,大量实验表明PGRN在乳腺癌、肺癌、肝癌、结直肠癌等多种上皮性肿瘤中表达上调,且其表达水平与肿瘤的预后密切相关,可作为患者预后情况预测的指标之一;可能通过PI3K/Akt、ERK等信号通路影响肿瘤细胞的生长增殖、迁移侵袭、免疫逃逸及耐药等进展过程。而目前尚未有关于颗粒蛋白前体在口腔鳞状细胞癌中作用的研究。
因此,本实验旨在通过增强或抑制颗粒蛋白前体的表达来阐明其对人口腔鳞状细胞癌细胞的增殖、迁移、侵袭等生物学行为的影响,以从体外探究PGRN在口腔鳞状细胞癌发生发展中的作用。
研究方法:1、敲减及过表达PGRN稳定转染细胞系的构建:构建包含PGRN干扰序列及包含PGRN全长序列慢病毒载体,分别对口腔鳞癌细胞CAL27、SCC15进行转染,分组为:敲减组(shPGRN)、敲减对照组(shNC)、过表达组(oePGRN)、过表达对照组(oeNC);real-time PCR验证敲低PGRN及过表达PGRN的效果。
2、敲减及过表达PGRN对细胞增殖、迁移、侵袭的影响:通过CCK-8法及平板克隆形成实验检测敲减及过表达PGRN对细胞生长及增殖的影响;通过Transwell迁移实验及划痕实验确定敲减及过表达PGRN对细胞迁移的影响;通过Transwell基底膜侵袭实验确定敲减及过表达PGRN对细胞侵袭的影响。
3、利用免疫组化方法检测12例口腔鳞癌患者癌及癌旁组织中PGRN的表达情况是否存在差异。
结果:1、免疫组织化学结果显示PGRN在口腔鳞癌中较癌旁表达上调。
2、通过real-time PCR从基因水平验证构建成功敲减及过表达PGRN的口腔鳞癌细胞系,并筛选出干扰序列LV-GRN-RNAi21856-1、LV-GRN-RNAi21857-1效果更佳,慢病毒转染时感染复数(MOI)为5。
3、在口腔鳞癌细胞系CAL27、SCC15中敲低PGRN后,与对照组相比生长明显减慢,克隆形成实验显示集落形成减少。迁移实验表明细胞迁移能力明显下降。Transwell实验表明能穿过小室及基质胶的细胞数明显减少。
4、在口腔鳞癌细胞系CAL27、SCC15中过表达PGRN后,与对照组相比生长明显增快,克隆形成实验显示集落形成增多。迁移实验表明细胞迁移能力明显上升。Transwell实验表明能穿过小室及基质胶的细胞数明显增多。
结论:PGRN可增强口腔鳞癌细胞(CAL27、SCC15)的生长增殖、迁移和侵袭能力,对口腔鳞癌的发生发展起促进作用。
参考文献
[1]Progranulin mediates immune evasion of pancreatic ductal adenocarcinoma through regulation of MHCI expression.Cheung Phyllis F.;Yang JiaJin;Fang Rui;Borgers Arianna;Krengel Kirsten;Stoffel Anne;Althoff Kristina;Yip Chi Wai;Siu Elaine H.L.;Ng Linda W.C.;Lang Karl S.;Cham Lamin B.;Engel Daniel R.;Soun Camille;Cima Igor;Scheffler Bj?rn;Striefler Jana K.;Sinn Marianne;Bahra Marcus;Pelzer Uwe;Oettle Helmut;Markus Peter;Smeets Esther M.M.;Aarntzen Erik H.J.G.;Savvatakis Konstantinos;Liffers Sven Thorsten;Lueong Smiths S.;Neander Christian;Bazarna Anna;Zhang Xin;Paschen Annette;Crawford Howard C.;Chan Anthony W.H.;Cheung Siu Tim;Siveke Jens T..Nature Communications,2022
[2]GP88/PGRN Serum Levels Are Associated with Prognosis for Oral Squamous Cell Carcinoma Patients.Greither Thomas;Steiner Tina;Bache Matthias;Serrero Ginette;Otto Sven;Taubert Helge;Eckert Alexander W.;Kappler Matthias.Biology,2021
[3]Global Cancer Statistics 2020:GLOBOCAN Estimates of Incidence and Mortality Worldwide for 36 Cancers in 185 Countries.Sung Hyuna;Ferlay Jacques;Siegel Rebecca L.;Laversanne Mathieu;Soerjomataram Isabelle;Jemal Ahmedin;Bray Freddie.CA:A Cancer Journal for Clinicians,2021
[4]PGRN-/-TAMs-derived exosomes inhibit breast cancer cell invasion and migration and its mechanism exploration..Yue Shujun;Ye Xiangsen;Zhou Ting;Gan Delu;Qian Husun;Fang Wenli;Yao Mengli;Zhang Dian;Shi He;Chen Tingmei.Life sciences,2020
[5]徐文惠.PGRN对口腔鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的影响[D].山东大学,2023.