背景[1-3]
人神经胶质细胞瘤细胞是一种肿瘤细胞，起源于神经胶质细胞。该细胞可以被用于研究神经胶质细胞瘤的生物学特征、药物筛选和肿瘤治疗等。
神经胶质细胞瘤是最常见的神经系统的肿瘤，其中胶质母细胞瘤是一种恶性胶质瘤，是成人最常见的颅内恶性肿瘤。U251细胞属于胶质母细胞瘤细胞系，该细胞具有贴壁生长的特征，并且在适当的培养条件下可以维持肿瘤细胞的恶性表型。
U251细胞可以用于研究神经胶质细胞瘤的生物学特征，如细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期和细胞凋亡等。此外，U251细胞还可以用于药物筛选和肿瘤治疗的研究，如化疗药物筛选、放疗效果评估和基因治疗等。
人神经胶质细胞瘤细胞
人神经胶质细胞瘤细胞培养步骤：
一．人神经胶质细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：
1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
二．人神经胶质细胞瘤细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）人神经胶质细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
下面T25瓶为例；
1．细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗瓶底1-2次后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入2ml完全培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2．1000RPM离心5分钟去掉上清。用血清重悬浮，加DMSO至最终浓度为10%。加入DMSO后迅速混匀，按每1ml的数量分配到冻存管中，注意冻存管做好标识。明舟生物（mingzhoubio）按每个冻存管细胞数目大于1X106个细胞冻存。
3．将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人神经胶质细胞瘤细胞可以用于辣椒素影响神经胶质瘤细胞自噬的机制及意义研究
探讨神经胶质瘤中辣椒素与自噬的作用及关系及其作用机制和临床意义。
方法:1.应用免疫组化ElivisionTMplus法检测151例人不同级别神经胶质瘤组织(实验组)和20例水肿脑组织(对照组)中的自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B和mTOR蛋白的表达情况;并分析上述因子与胶质瘤患者与临床病理参数及预后(整体生存期、无瘤生存期)之间的关系。
2. 实验分组1:分别用自噬诱导剂雷帕霉素(对照组)、辣椒素及雷帕霉素+辣椒素联合处理人胶质母细胞瘤T98G和人星形细胞瘤U373细胞株,观察自噬相关蛋白SQSTM1/p62和Beclin1在各组中表达水平的差异。
3. 实验分组2:构建抑制自噬的mTOR表达质粒,将实验分为(1)空白对照组(2)空载体组(3)mTOR过表达组(4)辣椒素组(5)mTOR过表达+辣椒素组。运用Lipofectamin3000试剂盒瞬时转染T98G和U373细胞株,CCK-8试剂盒检测上述各组细胞的增殖情况的差异;qRT-PCR检测上述各组细胞的mRNA水平差异;WB检测上述各组中自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B、ATG5和Beclin1表达水平的差异。
结果:1.免疫组化结果显示:自噬相关蛋白SQSTM1/p62、LC3B在高级别神经胶质瘤中的表达较高,在低级别神经胶质中的表达较低;而自噬抑制蛋白mTOR在高级别神经胶质瘤中的表达较低,在低级别神经胶质中的表达较高;
2. Speraman统计分析结果显示:LC3B、SQSTM1/p62和mTOR均与患者总体生存期和无瘤生存期有显著相关性(P<0.05),LC3B、SQSTM1/p62蛋白高表达的患者总体生存期及无瘤生存期均显著低于LC3B、SQSTM1/p62蛋白低表达患者;而mTOR蛋白高表达患者的总体生存期及无瘤生存期均显著高于mTOR蛋白低表达患者;
3. WB结果显示:辣椒素和自噬诱导剂雷帕霉素处理T98G和U373细胞时,SQSTM1/p62和Beclin1蛋白表达均升高,提示辣椒素与雷帕霉素具有协同作用;
4. CCK8细胞动力和WB结果显示:辣椒素可致胶质瘤细胞增殖能力减弱,并伴随自噬相关蛋白SQSTM1/p62、ATG4B、ATG5、Beclin1表达升高和mTOR蛋白表达降低;过表达mTOR可致胶质瘤细胞增殖能力增强,并伴随自噬相关蛋白SQSTM1/p62、ATG4B、ATG5和Beclin1表达降低;mTOR过表达+辣椒素组相较于空白对照组,自噬蛋白SQSTM1/p62、ATG4B和ATG5表达升高,Beclin1、mTOR表达降低。
5.qRT-PCR结果显示:辣椒素处理后SQSTM1/p62、Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA水平均显著升高;mTOR过表达质粒组SQSTM1/p62、Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA水平均显著降低;mTOR过表达+辣椒素组SQSTM1/p62 mRNA表达水平相较于空白对照组降低,Beclin-1、ATG5和LC3-ⅡmRNA表达水平显著升高。以上结果提示辣椒素可能是通过mTOR发挥作用。
参考文献
[1]Adeno-associated virus 2 mediated gene transfer of vascular endothelial growth factor Trap:a new treatment option for glioma.Zhao;;Zhang;;Wang;;Yang;;Zou;;Gao.Cancer Biology&Therapy,2019
[2]mTOR Regulates Phase Separation of PGL Granules to Modulate Their Autophagic Degradation.Gangming Zhang;;Zheng Wang;;Zhuo Du;;Hong Zhang.Cell,2018
[3]Aspirin affects tumor angiogenesis and sensitizes human glioblastoma endothelial cells to temozolomide,bevacizumab,and sunitinib impairing VEGF-related signaling.Stefania Elena Navone;;Laura Guarnaccia;;Chiara Cordiglieri;;Francesco Maria Crisà;;Manuela Caroli;;Marco Locatelli;;Luigi Schisano;;Paolo Rampini;;Monica Miozzo;;Nicla La Verde;;Laura Riboni;;Rolando Campanella;;Giovanni Marfia.World Neurosurgery,2018
[4]lncRNAs as potential molecular biomarkers for the clinicopathology and prognosis of glioma:A systematic review and meta-analysis.Qian Zhou;;Jing Liu;;Jing Quan;;Wenlan Liu;;Hui Tan;;Weiping Li.Gene,2018
[5]王京萍.辣椒素影响神经胶质瘤细胞自噬的机制及意义研究[D].蚌埠医学院,2021.