背景[1-3]
兔气管上皮细胞是一种常用的实验细胞，可以用于研究呼吸系统疾病和药物筛选等。这些细胞来源于兔子的气管组织，具有与体内组织相似的形态结构和功能活动，因此被广泛应用于基础和临床研究。
兔气管上皮细胞具有多种特点，例如可以作为气道与外界环境接触的第一道防线，合成和释放多种炎性介质和细胞因子参与气道炎症及免疫反应。此外，这些细胞还可以用于研究气道修复和再生等方面的机制。
在分离和培养兔气管上皮细胞时，通常采用链霉蛋白酶-中性蛋白酶混合消化法结合差速贴壁法等方法，以获得纯度和活性较高的细胞。此外，对于细胞的检测和鉴定也是非常重要的一步，可以通过免疫荧光等方法来确认细胞的身份和纯度。
兔气管上皮细胞
兔气管上皮细胞培养步骤：
一．兔气管上皮细胞培养基及培养冻存条件准备：
1)准备：DMEM+10%FBS+1%P/S
2)培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3)冻存液：50%basal medium+40%FBS+10%DMSO。
二．兔气管上皮细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
注：次传代推荐传代比例为1:2，以后传代比例可根据客户需要自己决定。
3）兔气管上皮细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
应用[4-5]
兔气管上皮细胞可以用于兔气管黏膜上皮细胞原代培养的研究
拟建立气管黏膜上皮细胞原代培养模型,观察细胞在体外生长及传代的规律,为组织工程气管假体的上皮化提供技术支持。
方法：一、兔气管上皮细胞分离培养：(1)从4月龄新西兰大耳兔取出气管(甲状软骨至气管分叉),剔除气管周围纤维结缔组织,冲洗气管至苍白并且无黏液为止。(2)剪开气管、撕取黏膜,将黏膜置于含有抗生素的PBS液中浸泡除菌。(3)将黏膜剪成约1m×1mm大小的小块。(4)将黏膜组织小块移入培养瓶中,置入培养箱培养。(5)对培养的细胞采用刮除法结合消化排除法纯化。
二、兔气管上皮细胞细胞鉴定：对纯化后的细胞通过SABC法免疫组化鉴定、FITC标记的荧光抗体免疫荧光鉴定。
三、兔气管上皮细胞传代与冻存：(1)对纯化的细胞进行传代研究,并观察细胞在体外的生长规律。(2)对纯化后的细胞进行冻存与复苏的研究。
结果：一、细胞培养：(1)培养约5-6d可见组织块边缘少量上皮样细胞爬出。此后,组织块周围上皮样细胞覆盖面积逐渐增大,细胞呈现三角形、梭形、圆形、多角形、不规则形等。高倍镜下可见部分细胞顶面伸出纤毛,在培养液中不断摆动。10d后去除组织块,14-15d时,细胞基本长满瓶壁,有纤毛的细胞无增殖。(2)通过刮除法结合消化排除法纯化后的细胞纯度较高。
兔气管上皮细胞鉴定：(1)SABC法染色检测细胞中角蛋白,胞质棕黄色,胞核淡蓝色,结果表明分离培养的细胞为上皮细胞。(2)FITC标记的荧光抗体检测细胞中的角蛋白,胞质亮绿色,可见整个细胞形态,表明分离培养的细胞为上皮细胞。
兔气管上皮细胞传代与冻存：(1)细胞可以连续传代至第5代,传代后细胞贴壁及生长良好,细胞随着代数的增加细胞体积逐渐变大。传代后未见有纤毛的细胞。第2-4代细胞贴壁及生长时问无明显差异,第5代细胞贴壁数量明显减少,生长缓慢,细胞体积与前几代相比明显变大。(2)本实验复苏冻存3个月的细胞,复苏后细胞存活率、贴壁率较高。经过本方法冻存与复苏的细胞,经过体外培养,细胞活性、增殖能力仍然能够恢复到冻存前水平。
结论：本实验应用组织块法成功构建出一种较为经济、便捷、可传代、可重复的兔气管黏膜上皮细胞的原代培养模型。成功对培养细胞进行鉴定、传代与冻存的研究,为气管黏膜上皮细胞培养提供了技术可行性,为组织工程人工气管的上皮化提供理论基础与技术支持。
参考文献
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