背景[1-3]
MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系是一种来源于小鼠睾丸间质组织的肿瘤细胞系，通常被用于研究生殖生物学、激素调控以及与睾丸功能相关的生理和病理过程。
MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系是从C57BL/6小鼠移植的M548OP Leydig细胞肿瘤中建立。MLTC-1细胞保留了原始肿瘤对激素的反应，在人绒毛膜促性腺激素(hCG)、黄体激素、霍乱毒素、氟化钠和脒基-5'-亚氨基二磷酸盐处理下，MLTC-1细胞的膜腺苷酸环化酶活性提高；在hCG作用下，MLTC-1细胞还可生成黄体酮。MLTC-1细胞表达绒毛膜促性腺激素、黄体生成素。MLTC-1细胞呈粘附生长，细胞形成岛状单层不融合。MLTC-1细胞可以用于3D细胞培养，也是一种合适的转染宿主。
MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系
MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系培养步骤：
1）复苏MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。
应用[4-5]
MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系可以用于养精胶囊通过LncRNA H19调控StAR促进睾酮合成的作用机制
从体内外实验出发,研究养精胶囊是否通过Lnc RNA H19调控St AR,进而发挥促进睾酮合成的作用。
【方法】1.动物实验:将BALB/c老年雄性LOH模型小鼠、BALB/c年轻雄性小鼠作为动物实验对象,分为对照组、养精胶囊混悬液(YCS)处理组(低、中、高剂量)和年轻组,连续灌胃4周。通过HE染色观察小鼠睾丸组织形态;通过石蜡切片免疫组化观察St AR蛋白在小鼠睾丸组织中的定位和表达情况;通过ELISA测定小鼠血清睾酮和游离睾酮浓度;通过q RT-PCR和Western Blot分别检测小鼠睾丸组织中St AR、Lnc RNA H19、Micro RNA Let7b m RNA和St AR蛋白的表达。
2. 细胞实验:将MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系作为体外细胞实验对象,培养至对数生长期,加入低(0.01mg/ml)、中(0.1mg/ml)、高(1mg/ml)剂量养精胶囊水提物(YCWE)处理24小时,通过ELISA测定细胞上清睾酮浓度,通过q RT-PCR和Western Blot分别检测MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞中St AR、Lnc RNA H19、Micro RNA Let7b m RNA和St AR蛋白的表达。构建敲低Lnc RNA H19的慢病毒稳定株,随后加入高剂量YCWE处理24小时,通过q RT-PCR和ELISA分别检测Lnc RNA H19、St AR m RNA和细胞上清睾酮水平。
【结果】1.动物实验:YCS能够显著增加LOH模型小鼠血清睾酮和游离睾酮浓度;上调小鼠睾丸组织中Lnc RNA H19、St AR m RNA和St AR蛋白的表达,下调Micro RNA Let7b m RNA的表达;YCS能够增加小鼠Leydig细胞数目。
2.细胞实验:YCWE能够增加细胞上清睾酮浓度;上调MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞中Lnc RNA H19、St AR m RNA和St AR蛋白的表达,下调Micro RNA Let7b m RNA的表达。构建敲低Lnc RNA H19的慢病毒稳定株后,MLTC-1小鼠睾丸间质细胞瘤细胞系细胞中Lnc RNA H19、St AR m RNA和细胞上清睾酮水平均显著下降;YCWE干预后,Lnc RNA H19和St AR m RNA的表达均上调,细胞上清睾酮浓度显著增加。
参考文献
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[5]王丹丹.养精胶囊通过LncRNA H19调控StAR促进睾酮合成的作用机制[D].东南大学,2022.