背景[1-3]
FRHK-4恒河猴胚肾细胞系是一种常用的细胞系，源自300克重恒河猴正常雌性胚胎的肾组织。这种细胞系是上皮细胞样的连续细胞株，已经被数家实验室用作甲型肝炎研究。
FRHK-4恒河猴胚肾细胞系具有上皮细胞的特性，生长特征是贴壁生长。其倍增时间大约为每周2至3次，可以在含有优质胎牛血清的DMEM-H培养基中培养。该细胞系已通过支原体检测，是连续细胞系，适合于一般上皮细胞的培养。
在培养过程中，应将FRHK-4恒河猴胚肾细胞系放在含有95%空气和5%二氧化碳的培养箱中，温度维持在37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
FRHK-4恒河猴胚肾细胞系
FRHK-4恒河猴胚肾细胞系培养步骤：
1）复苏FRHK-4恒河猴胚肾细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）FRHK-4恒河猴胚肾细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）FRHK-4恒河猴胚肾细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。弃培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入到冻存液中。
应用[4-5]
FRHK-4恒河猴胚肾细胞系可以用于猪轮状病毒实时定量荧光PCR检测方法的建立
猪轮状病毒(Porcine Rotavirus,PRV)属于呼肠孤病毒科、轮状病毒属,它作为腹泻的主要病原在世界范围内广泛流行,是引起仔猪病毒性腹泻的主要病原之一。该病幼畜最为易感,1～4周龄仔猪发病率超过80%,死亡率7～20%,且症状严重,主要表现为严重腹泻,部分病例因严重脱水、酸碱平衡失调、继发感染而死亡。鉴于其危害严重且没有有效治疗手段,所以对于轮状病毒的提前诊断预防尤其重要。在轮状病毒的检测技术中,实时荧光定量PCR(real time fluorescent quantitative PCR,real time FQ-PCR)大多都以SYBR GreenⅠ染料提供荧光信号,能够有效解决常规PCR的污染问题,特异性更强,自动化程度更高,可满足对多种样本检测的需要,已经得到广泛的认可。
实验先从甘肃某猪场发生腹泻的猪群中采集粪便样品,用FRHK-4恒河猴胚肾细胞系培养,并扩增了PRV,再根据Genebank上已提交的多株猪轮状病毒VP6基因编码序列,利用primers premier 5.0软件设计引物。对采集的样品进行处理及病毒RNA抽提,以Oligo(dT)18为反转录的引物,将RNA反转录为cDNA,进而以设计的一对引物及合适的条件进行PCR扩增,目的是建立一种快速、准确、特异的PRV real time FQ-PCR检测方法。
本实验对FRHK-4恒河猴胚肾细胞系细胞、病毒做了扩增培养,成功提取出病毒RNA并将其反转录成cDNA,扩增出长1100bp左右的基因片段,初步建立了荧光定量检测方法,根据最后得到荧光定量PCR图,看出阴性样品与空白对照的荧光曲线均为直线,而阳性样品荧光曲线则有很明显的上升,且曲线上升高低与模板浓度呈正比,且可初见“S”型曲线。本次试验为今后进行PRV分子流行病学研究、分子诊断试剂的开发以及基因工程疫苗的研制提供了一些理论依据和物质基础。
参考文献
[1]Generation of recombinant human monoclonal antibodies to rotavirus from single antigen-specific B cells selected with fluorescent virus-like particles..Journal of Immunological Methods,2003
[2]The use of NASBA for the detection of microbial pathogens in food and environmental samples.Nigel Cook.Journal of Microbiological Methods,2003
[3]Simultaneous detection and identification of hepatitis A virus and rotavirus by multiplex nucleic acid sequence-based amplification(NASBA)and microtiter plate hybridization system..Journal of Virological Methods,2002
[4]Quantitative monitoring of the PRAME gene for the detection of minimal residual disease in leukaemia.MaikoMatsushita;HideyukiIkeda;MasahiroKizaki;ShinichiroOkamoto;MasahiroOgasawara;YasuoIkeda;YutakaKawakami.British Journal of Haematology,2001
[5]宋昌军.猪轮状病毒实时定量荧光PCR检测方法的建立[D].西北民族大学,2010.