背景[1-3]
小鼠巨噬细胞是一种存在于小鼠体内的免疫细胞，也称为巨噬细胞系。巨噬细胞是一种多能性干细胞，可以分化为多种类型的细胞，包括树突状细胞、粒细胞和单核细胞等。
小鼠巨噬细胞在免疫系统中起着重要的作用。它们可以吞噬和消化细菌、病毒和其他微生物，从而保护机体免受感染。此外，巨噬细胞还可以分泌多种细胞因子和趋化因子，调节免疫反应的发生和发展。
在医学研究中，小鼠巨噬细胞被广泛用于研究免疫系统的功能和疾病机制。例如，通过将特定的基因导入小鼠巨噬细胞中，可以研究这些基因对免疫系统的影响。此外，由于小鼠和人类的免疫系统存在一定的相似性，因此小鼠巨噬细胞也被用于研究人类免疫相关疾病的发病机制和治疗方法。
小鼠巨噬细胞
小鼠巨噬细胞培养操作
1)复苏小鼠巨噬细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)小鼠巨噬细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)小鼠巨噬细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
小鼠巨噬细胞可以用于贾第虫胞外囊泡激活小鼠巨噬细胞NLRP3炎性小体的分子机制
分离鉴定贾第虫胞外囊泡(GEVs),从GEVs诱导小鼠巨噬细胞细胞炎性应答角度研究,分析参与这一过程的关键炎性小体及其激活的分子机制;并分析GEVs中的蛋白质组份信息,确定激活NLRP3炎性小体的单分子;最后通过动物试验,确定GEVs关键分子介导的NLRP3炎性小体激活对虫体感染的影响,进一步揭示其在贾第虫致病中的作用。
1) GEVs刺激小鼠巨噬细胞模型建立。超速离心富集贾第虫滋养体分泌的GEVs,透射电镜下呈典型“杯状”结构,粒径大小为150 nm;激光共聚焦观察GEVs能够被宿主细胞主动吞噬进入胞内,并呈现时间依赖性;荧光定量PCR和ELISA实验测定GEVs能够激活小鼠腹腔巨噬细胞炎性应答,并引起多种炎性细胞因子和趋化因子转录及分泌水平升高,且呈现剂量依赖性。结果表明贾第虫能够分泌GEVs,且可以进入宿主细胞内激活宿主细胞炎性应答。
2) 2)GEVs激活宿主小鼠巨噬细胞PRRs分子类型鉴定。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞后引起多种NLRs和TLRs转录水平升高,其中NLRP3和TLR2升高最为显著;GEVs刺激使NLRP3受体呈现点状激活并聚集于细胞核周围、TLR2受体大量表达于细胞膜上;通过钾离子外流和溶酶体损伤途径阻断NLRP3受体和阻断TLR2受体均可以显著下调多种炎性细胞因子和趋化因子转录水平、多种炎性细胞因子分泌水平和IL-1βp17蛋白表达水平。结果表明GEVs通过激活宿主TLR2和NLRP3信号通路调控宿主巨噬细胞炎性应答。
3) GEVs激活小鼠巨噬细胞炎性小体第二信号的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞引起NLRP3炎性小体关键蛋白基因转录水平升高,在感染后6 h～24 h范围内caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈现先升高到12 h达到峰值然后降低的趋势,在12.5μg～25μg范围内caspase-1 p20的活化和IL-1βp17的分泌呈现剂量依赖性升高;通过阻断钾离子外流途径、溶酶体损伤途径、caspase-1活化途径、泛caspase-1激活途径阻断NLRP3炎性小体激活,可以不同程度下调IL-1β的基因转录、蛋白分泌和表达,且溶酶体损伤途径和泛caspase-1途径更为显著;阻断IL-1β后能够显著下调其它炎性细胞因子IL-6和TNF-α的转录和分泌水平。结果表明GEVs能够通过溶酶体损伤途径激活宿主NLRP3炎性小体,调控IL-1βp17的分泌并介导宿主炎性应答。
4)GEVs激活小鼠巨噬细胞炎性小体第一信号的研究。GEVs刺激小鼠腹腔巨噬细胞和THP-1细胞均能促进贾第虫介导的NLRP3炎性小体第一信号pro-IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌;GEVs刺激宿主细胞,在0h～4 h内,引起p38在2 h磷酸化水平达到峰值、ERK和AKT在4 h磷酸化达到峰值,阻断p38和ERK通路可以显著下调IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌,而阻断AKT通路可以显著上调这些炎性因子的转录和分泌;GEVs刺激宿主细胞,可引起NF-κB p65入核,在0 h～4 h内,引起p-p65和p-IKKαβ均在1 h磷酸化水平达到峰值而T-IκBα降解至最低水平,阻断IκBα磷酸化来抑制NF-κB通路可以显著下调NLRP3炎性小体第一信号IL-1β和其它炎性因子IL-6/TNF-α的转录和分泌。
参考文献
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