背景及概述[1]
shRNA文库构建为构建RNAi文库的中间环节，RNA干扰(RNAinterference，RNAi)在绝大多数真核生物中是一种保守的调控基因表达的机制，生物体内长链dsRNA(DoublestrandRNA，dsRNA)经过类RNaseIII的核酸内切酶Dicer/DCLs加工处理成21−24ntsiRNA(SmallinterferenceRNA，siRNA)，随后siRNA进入RNA诱导的沉默复合体(RISC)，实现对靶基因的特异性降解，即PTGS(Post-transcriptionalgenesilencing)。shRNA(shorthairpinRNA，小发卡RNA)介导的RNA干扰(RNAinterference，RNAi)技术逐渐成为哺乳动物功能基因研究的重要途径和方法，以其为基础的RNAi文库技术将会大大提升RNAi功效，为开展大规模、高通量的基因功能。有研究利用DNA酶学工程方法(SmallinterferingRNAproductionbyenzymaticengineeringofDNA，SPEED)构建了小鼠胚胎siRNA文库，其中包含shRNA文库构建过程。
shRNA文库构建过程如下：该方法是基于内切酶MmeI[TCCRAC(N)20]能够在距离识别位点20bp处切割双链DNA，从而形成含有20bp的短发卡结构DNA，该结构可以在体内转录为短的发卡RNA(ShorthairpinRNA，shRNA)。该方法首先将目的DNA片段用识别4碱基的内切酶(AciI，HpaI，HpyCH4IV，HinPI，TaqI)进行消化，产生出粘性末端相同但长度不等的DNA片段，然后与人工合成的43nt具有小发卡结构的寡核苷酸片段相连，连接产物经MmeI酶切并回收形成单链形态的发卡DNA(HairpinDNA，hpDNA)，然后与人工合成的寡核苷酸片段连接，随后在BstDNA聚合酶作用下，通过引物延伸和链置换使单链hpDNA转变为具有反向重复结构的dsDNA，通过合适的酶切位点消化后将它们克隆到表达载体上。利用该方法建立的shRNA文库含有3.0×106个克隆。
主要参考资料
[1] RNA干扰(RNAi)文库研究进展