背景[1-3]
HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系是一种来源于人类肺微血管内皮细胞的人源性肿瘤细胞系。这种细胞系在实验室中广泛用于研究肺微血管内皮细胞的生物学特性、药物筛选和治疗策略的开发。
HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系具有以下特点：
形态特征：HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系呈多边形或长方形，具有丰富的胞质和较小的核。
生长特性：HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系在体外培养条件下生长迅速，具有较高的增殖能力。
遗传特征：HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系具有人类染色体的正常核型，但可能存在某些基因突变或表达异常。
药物敏感性：HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系对多种化疗药物(如顺铂、紫杉醇等)具有敏感性，可作为药物筛选的模型细胞。
研究应用：HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系广泛应用于肺微血管内皮细胞的基础研究，包括肿瘤发生机制、分子靶点研究、药物筛选和治疗策略评估等。
虽然HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系具有一定的代表性，但仍存在局限性。因此，在进行实验研究时，应结合其他来源的细胞系和动物模型，以获得更全面的研究结果。
HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系
HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系培养操作
1)复苏HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系可以用于PIEZO1调控急性损伤致肺内皮细胞铁死亡的机制研究
研究电离辐射(IR)或氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的急性肺损伤是否发生了铁死亡,并确定PIEZO1是否可以调控急性肺损伤中肺内皮细胞铁死亡及其机制。
方法1、验证电离辐射或OGD/R诱导急性肺损伤后铁死亡的相关变化,主要包括:(1)通过免疫组化验证C57BL/6小鼠肺部接受电离辐射后铁死亡相关蛋白GPX4和SLC7A11的变化。(2)通过Western blot验证电离辐射或OGD/R处理后C57BL/6小鼠和HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系铁死亡相关蛋白GPX4,SLC7A11,DMT1和ACSL4的变化。(3)通过透射电镜观察肺内皮细胞线粒体的变化。(4)通过流式细胞技术验证电离辐射或OGD/R后脂质过氧化、活性氧(ROS)的变化。
2、通过免疫组化验证C57BL/6小鼠肺部接受电离辐射后肺血管内皮PIEZO1的变化及Western blot验证电离辐射或OGD/R后肺内皮细胞PIEZO1的表达变化。
3、通过Western blot,流式细胞技术和透射电镜验证GsMTx4(PIEZO1的抑制剂),Yoda1(PIEZO1的激动剂)对于电离辐射或OGD/R诱导的C57BL/6小鼠和HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系铁死亡的影响。
4、通过钙离子荧光探针和钙蛋白酶活性的测定验证肺内皮细胞发生铁死亡时钙离子和钙蛋白酶作为下游信号通路的变化,以及抑制钙蛋白酶活性对铁死亡相关蛋白GPX4,SLC7A11,DMT1和脂质过氧化,活性氧的影响。确定PIEZO1是否通过钙/钙蛋白酶调节电离辐射或OGD/R诱导C57BL/6小鼠和HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系铁死亡。
5、在15-Gy电离辐射构建的急性肺损伤模型中,通过免疫组化验证肺内皮VE-cadherin的变化。采用Western blot验证Yoda1或电离辐射刺激肺内皮细胞VE-cadherin降解的变化。验证siRNA敲低VE-cadherin及过表达VE-cadherin对肺内皮细胞发生铁死亡样变化的影响,主要包括脂质过氧化,活性氧和透射电镜。
结果1、C57BL/6小鼠和HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系接受15-Gy电离辐射后,铁死亡的相关指标GPX4,SCL7A11表达减少,DMT1表达增多。人肺微血管内皮细胞(HULEC-5a)接受15-Gy电离辐射后,发生ROS聚集和脂质过氧化;透射电镜观察到线粒体变小,膜密度增高;HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系接受OGD/R处理后,铁死亡的相关指标GPX4,SCL7A11蛋白表达减少,ACSL4蛋白表达增加,发生脂质过氧化和ROS聚集。
2、免疫组化结果显示电离辐射可以诱导小鼠PIEZO1表达增多,Western blot证明电离辐射或OGD/R诱导HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系PIEZO1表达增加。
3、不仅仅电离辐射或OGD/R可以诱导HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系发生铁死亡,Yoda1单独处理HULEC-5A人肺微血管内皮细胞系,也发生了ROS聚集和脂质过氧化;透射电镜也观察到细胞的线粒体变小,膜密度增高;GPX4,SLC7A11蛋白表达减少,DMT1蛋白表达增加。GsMTx4可以逆转OGD/R或电离辐射或Yoda1导致的这些铁死亡现象。
参考文献
[1]The role of ferroptosis in acute lung injury[J].Liu,Xin;Zhang,Junqiang;Xie,Wang.Molecular and Cellular Biochemistry,2022
[2]APR-246 induces early cell death by ferroptosis in acute myeloid leukemia.[J].Birsen Rudy;Larrue Clement;Decroocq Justine;Johnson Natacha;Guiraud Nathan;Gotanegre Mathilde;CanteroAguilar Lilia;Grignano Eric;Huynh Tony;Fontenay Michaela;Kosmider Olivier;Mayeux Patrick;Chapuis Nicolas;Sarry Jean Emmanuel;Tamburini Jerome;Bouscary Didier.Haematologica,2022
[3]Hepcidin Promoted Ferroptosis through Iron Metabolism which Is Associated with DMT1 Signaling Activation in Early Brain Injury following Subarachnoid Hemorrhage[J].Zhang Hongxia;Ostrowski Robert;Jiang Dengzhi;Zhao Qing;Liang Yidan;Che Xudong;Zhao Jun;Xiang Xiang;Qin Wang;He Zhaohui.Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2021
[4]VX765,a Specific Caspase-1 Inhibitor,Alleviates Lung Ischemia Reperfusion Injury by Suppressing Endothelial Pyroptosis and Barrier Dysfunction[J].Wu Siyi;Li Zhao;Ye Mengling;Liu Chunxia;Liu Hao;He Xiaojing;Qin Yi;Liang Fangte;Pan Linghui;Lin Fei.BioMed Research International,2021
[5]郭雪微.PIEZO1调控急性损伤致肺内皮细胞铁死亡的机制研究[D].锦州医科大学,2022.