背景[1-7]
(-)-Blebbistatin(ATPase抑制剂)是一种细胞渗透性抑制剂,作用于非肌球蛋白IIATPase,无细胞试验中IC50为~2μM,不抑制肌球蛋白轻链激酶,抑制卵裂沟的缢缩,不干扰有丝分裂或收缩环的组装。Blebbistatin抑制细胞分裂,改变鱼角膜细胞的平滑运动,且抑制缺乏细丝蛋白的细胞系进行自发起泡。Blebbistatin抑制非肌肉肌球蛋白IIA,非肌肉肌球蛋白IIB和兔骨骼肌肌球蛋白S1的HMM片段的酶活性,而不抑制平滑肌球蛋白。
Blebbistatin快速且可逆抑制Mg-ATPase活性,也抑制非肌肉肌球蛋白IIA和IIB的体外活性,而极其微弱抑制平滑肌肌球蛋白(IC50=80μM)。Blebbistatin有效抑制Dictyostelium肌球蛋白II,但极其微弱抑制Acanthamoeba肌球蛋白II。Blebbistatin不抑制代表性的I,V和X型肌球蛋白超家族成员。Blebbistatin不与核苷酸竞争性结合到骨骼肌肌球蛋白亚片段-1。
Blebbistatin优先结合到ATP酶,与ADP和磷酸盐在活性位点相互作用,减慢磷释放。Blebbistatin既不干扰肌球蛋白与肌动蛋白结合,也不干扰ATP诱导的肌动球蛋白解离。Blebbistatin是一种肌球蛋白抑制剂,主要对肌球蛋白II具有特异性。
它广泛用于研究抑制心肌肌球蛋白,非肌肉肌球蛋白II和骨骼肌肌球蛋白。(-)-Blebbistatin抑制肌球蛋白ATP酶活性,并以此方式抑制基于肌球蛋白的运动。它结合在核苷酸结合口袋和肌球蛋白的肌动蛋白结合裂缝之间的中途,主要在肌动蛋白分离的构象中。这种类型的抑制使肌动蛋白-肌球蛋白肌丝松弛并导致几种生物学效应。
II型肌球蛋白抑制的形成泡在黑素瘤细胞培养物中,因此它的名字。在细胞水平,blebbistatin也抑制胞质分裂,也可能破坏有丝分裂纺锤体的形成。取决于其他条件,可以增强或抑制细胞的迁移。在神经元中,发现blebbistatin促进神经突向外生长。在器官水平,blebbistatin可以阻止骨骼肌或心肌的收缩。还发现布雷他汀可稳定肌丝中的超松弛状态,其中肌球蛋白头部呈螺旋状排列并且彼此相互作用但不与肌动蛋白相互作用。Blebbistatin是非肌肉肌球蛋白IIA和IIB,心肌肌球蛋白,骨骼肌球蛋白和平滑肌的有效抑制剂,但不抑制肌球蛋白I,V和X。
应用[8][9]
(-)-Blebbistatin(ATPase抑制剂)可用于小鼠模型囊胚发育研究:
非肌肉肌球蛋白Ⅱ(non-muscle myosinⅡ,NMⅡ)ATP酶抑制剂(-)-Blebbistatin对小鼠早期胚胎体外发育过程及其干性相关基因表达的影响。方法采用SPF级ICR品系小鼠,对10只雌鼠采用孕马血清促性腺激素和人绒毛膜促性腺激素进行诱导超数排卵,雌鼠与雄鼠1︰1合笼。分别于E 0.5、E 1.5、E 2.5(受孕0.5、1.5、2.5天)收集胚胎。
桑椹胚随机分为对照组和实验组,对照组液滴为20μl Ksom培养基,实验组液滴为加入25μM(-)-Blebbistatin的20μl Ksom培养基,体外培养24小时。进行免疫荧光标记,观察小鼠胚胎中微丝骨架的分布情况,以及桑椹胚中nanog、Oct4、sox2、ssea1和estrogen等5个干性相关基因的表达情况。结果小鼠早期胚胎的发育经历细胞分裂后裂球数目增加、桑椹胚致密化、囊胚期囊胚腔的扩张过程。
(-)-Blebbistatin组胚胎则无法形成囊胚腔进入囊胚时期,大多数胚胎裂球松散,整体呈扁塌状。实验共重复3次,实验组胚胎共62枚,均未能形成囊胚;对照组胚胎共60枚,全部形成囊胚。(-)-Blebbistatin抑制NMⅡ后小鼠胚胎干性相关基因nanog,Oct4,sox2,ssea1,estrogen的表达均明显低于对照组(P值均﹤0.05)。结论抑制NMⅡATP酶活性会阻滞小鼠囊胚的体外发育,并降低干性相关基因的表达。
参考文献
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[3]Nonmuscle Myosin IIB Links Cytoskeleton to IRE1αSignaling during ER Stress[J].Yin He,Alexander Beatty,Xuemei Han,Yewei Ji,Xuefei Ma,Robert S.Adelstein,John R.Yates,Kenneth Kemphues,Ling Qi.Developmental Cell.2012(6)
[4]A DNA Repair Complex Functions as an Oct4/Sox2 Coactivator in Embryonic Stem Cells[J].Yick W.Fong,Carla Inouye,Teppei Yamaguchi,Claudia Cattoglio,Ivan Grubisic,Robert Tjian.Cell.2011(1)
[5]Microfilament Structure and Function in the Cortical Cytoskeleton[J].A Bretscher.Annual Review of Cell Biology.1991
[6]Cell surface and cytoskeletal elements:Cavitation in the mouse preimplantation embryo.Lynn M.Wiley,Martin A.Eglitis.Developmental Biology.1981
[7]Defects in cell adhesion and the visceral endoderm following ablation of nonmuscle myosin heavy chain II-A in mice.Conti Mary Anne,Even-Ram Sharona,Liu Chengyu,Yamada Kenneth M,Adelstein Robert S.Journal of Biological Chemistry.2004
[8]Oct4/Sox2-regulated miR-302 targets cyclin D1 in human embryonic stem cells.Card Deborah A Greer,Hebbar Pratibha B,Li Leping,Trotter Kevin W,Komatsu Yoshihiro,Mishina Yuji,Archer Trevor K.Molecular and Cellular Probes.2008
[9]郭峥,杜婧,常城.药物抑制非肌肉肌球蛋白Ⅱ对小鼠囊胚发育的影响[J].发育医学电子杂志,2017,5(04):238-243.