背景[1-3]
人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒是用于检测样本中补体成分5a（C5a）含量的一种实验工具，广泛应用于科研领域。C5a是补体系统的一种重要成分，具有高度的炎症性和趋化性。它参与多种生理和病理过程，如炎症反应、免疫调节、细胞凋亡等。因此，检测样本中的C5a含量对于研究这些过程具有重要意义。以下是关于人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒的详细介绍：
人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒
一、基本信息
产品名称：人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒
英文名称：Human Complement Fragment 5a(C5a)ELISA Kit
用途：仅供科研使用，用于定性或定量分析样本中的C5a含量
样本类型：包括血清、血浆、组织匀浆、细胞培养上清液等
检测原理：通常采用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA），通过抗原抗体反应和酶促反应，检测样本中的C5a含量
二、产品规格与价格
规格：常见的有48T和96T两种规格，具体取决于不同品牌和生产商
价格：价格因品牌、规格和市场供应情况而异，例如某些品牌的96T规格试剂盒价格约为1750元/盒起，具体价格需向供应商咨询
三、保存与使用
保存条件：通常需保存在2-8℃的低温环境中，避免阳光直射和潮湿
使用前准备：使用前需将试剂盒置于室温平衡一段时间（如20分钟），确保试剂温度与室温一致
操作步骤：按照试剂盒说明书进行操作，包括样本处理、加样、温育、洗涤、显色和测定等步骤
四、注意事项
操作规范：严格遵守实验室操作规范，避免交叉污染和假阳性/假阴性结果
样本处理：不同样本类型的处理方法可能有所不同，需按照说明书要求进行处理
结果分析：根据标准曲线计算样本中C5a的含量，注意结果的准确性和可重复性
五、操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温（试剂不能直接在37℃溶解）；试剂或样品稀释时，均需混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1.加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100μl，余孔分别加标准品或待测样品100μl，注意不要有气泡，加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37℃反应120分钟。为保证实验结果有效性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2.弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100μl（在使用前一小时内配制），酶标板加上覆膜,37℃反应60分钟。
3.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4.每孔加检测溶液B工作液（同检测A工作液）100μl，酶标板加上覆膜37℃反应60分钟。
5.温育60分钟后，弃去孔内液体，甩干，洗板5次，每次浸泡1-2分钟，350μl/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
6.依序每孔加底物溶液90μl，酶标板加上覆膜37℃避光显色（30分钟内，此时肉眼可见标准品的前3-4孔有明显的梯度兰色，后3-4孔梯度不明显，即可终止）。
7.依序每孔加终止溶液50μl，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。为了保证实验结果的准确性，底物反应时间到后应尽快加入终止液。
8.用酶联仪在450nm波长依序测量各孔的光密度（OD值）。在加终止液后立即进行检测。
应用[4][5]
人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒可以用于斑马鱼补体C5a/C5aR1的克隆及在细菌性炎症中的表达分析与功能研究
研究以斑马鱼为研究对象,通过感染不同浓度的嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila),评估感染后斑马鱼的生存与组织损伤情况、分析不同时间点补体C5a和受体C5a R1以及炎症相关细胞因子在不同组织中的表达模式,阐述斑马鱼细菌感染后C5a/C5a R1通路激活与炎症反应的关系。此外,通过在感染前对斑马鱼进行C5a R1拮抗剂(W-54011)预处理,探究其对斑马鱼细菌感染后炎症反应的影响,进一步探讨了补体C5a/C5a R1通路在斑马鱼应对病原菌感染的炎症反应进程中发挥的作用。
本文主要的研究结果如下:(1)通过克隆得到斑马鱼C5a和C5a R1的CDS序列,序列长度分别为228 bp和1041 bp,分别编码76和346个氨基酸。系统发育进化树显示斑马鱼C5a R1首先与其他鲤科鱼类聚合,其中草鱼(Ctenopharyngodon idella)与斑马鱼的亲缘关系最为密切,相似度为78.9%。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,q RT-PCR)和人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒检测结果显示,C5a和C5a R1在健康斑马鱼的肝、肠、脾、脑、鳃、皮肤、肌肉、心脏、眼睛、尾鳍、性腺11种组织中均有分布,其中C5a在肝脏中表达最高,C5a R1在脾脏中表达最高。(2)斑马鱼的存活率和组织损伤程度与细菌感染浓度密切相关。嗜水气单胞菌感染浓度为6.8×10～5、6.3×10～6、1.0×10～7、2.0×10～7、3.4×10～7、5.3×10～7和1.0×10～8CFU/m L时,斑马鱼存活率分别为100%、80%、63.3%、46.7%、16.7%、0和0。根据此结果选取3.0×10～7和1.0×10～7CFU/m L分别作为后续实验中处理组1(treatment group 1,TG1)和处理组2(treatment group 2,TG2)的感染浓度。对照组(control group,CG)存活率为100%,TG2的存活率为59.6%,显著高于TG1(23.3%)。组织病理切片显示,斑马鱼的肠损伤主要表现为黏膜层和黏膜固有层组织分离、小肠绒毛断裂和杯状细胞大量增多。感染后24 h时病理损伤最严重,48 h时开始有所减轻。相比之下,TG1的损伤程度较TG2更为严重,且恢复较慢。(3)严重的细菌感染导致C5a/C5a R1通路过度激活,且激活程度与细菌感染呈现剂量关系。q RT-PCR及人补体片断5a(C5a)Elisa试剂盒检测结果发现,嗜水气单胞菌感染后,与CG相比,TG1和TG2的肝、肠、脾、鳃中C5a、C5a R1的表达量显著上升,且两个基因的表达模式相同,主要表现为:在感染后72 h内,C5a和C5a R1在不同组织中的表达量均呈现先上升后下降的趋势。TG1中,C5a和C5a R1在感染后12 h或24 h时相对表达量达到最高,而TG2中在感染后24 h或48 h时相对表达量达到最高。此外,C5a和C5a R1在TG1四种组织中的相对表达水平均高于TG2。
参考文献
[1]Transcriptome,intestinal microbiome and histomorphology profiling of differences in the response of Chinese sea bass(Lateolabrax maculatus)to Aeromonas hydrophila infection[J].Pan Chao;Zhu Yanran;Cao Kaixin;Li Juexian;Wang Siyu;Zhu Jiahua;Zeng Xiaoman;Zhang Heqian;Qin Zhiwei.Frontiers in Microbiology,2023
[2]Intracellular complement C5a/C5aR1 stabilizesβ-catenin to promote colorectal tumorigenesis.[J].Ding Peipei;Xu Yanqing;Li Luying;Lv Xinyue;Li Ling;Chen Jianfeng;Zhou Danlei;Wang Xiaochao;Wang Qi;Zhang Wei;Liao Tian;Ji QingHai;Lei QunYing;Hu Weiguo.Cell reports,2022
[3]Immunosuppression participated in complement activation-mediated inflammatory injury caused by 4-octylphenol via TLR7/IκBα/NF-κB pathway in common carp(Cyprinus carpio)gills.[J].Sun Qi;Liu Yuhao;Teng Xiaojie;Luan Peng;Teng Xiaohua;Yin Xiujie.Aquatic toxicology(Amsterdam,Netherlands),2022
[4]The intestinal histopathology,innate immune response and antioxidant capacity of blunt snout bream(Megalobrama amblycephala)in response to Aeromonas hydrophila.[J].Zhang Chunnuan;Yuan Xiaoyu;Xu Ruiyi;Qi Qian;Wang Yang.Fish&shellfish immunology,2022
[5]刘鑫宝.斑马鱼补体C5a/C5aR1的克隆及在细菌性炎症中的表达分析与功能研究[D].青岛大学,2023.