背景及概述[1]
内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。小鼠淋巴管内皮细胞分离自淋巴管组织；淋巴管由毛细淋巴管汇合而成。其形态结构与静脉相似，但管径较细，管壁较薄，瓣膜较多且发达，外形呈串珠状。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带来源充足，取材、操作方便，因而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。脐静脉内皮细胞的体外培养受许多因素的影响，通常采用的培养方法加入促细胞贴壁、增殖的辅助因子，如明胶、血管内皮细胞生长因子、肝素等，可能成为干扰实验结果的混杂因素.目前蛋白酶消化解离内皮细胞已取代了用机械刮取来获得脐静脉内皮细胞。由于内皮细胞是被覆于血管内腔的一层菲薄的细胞，酶液的性质是影响分离效果的决定性因素，需选用适当的酶、浓度及作用时间，否则会损伤内皮细胞，甚至会将内皮细胞下层的结缔组织消化下来，影响内皮细胞培养的纯度。从分离细胞数量、保持细胞活性和结构完整性来看，胶原酶是理想的血管内皮细胞分离酶，自成功分离脐静脉内皮细胞以来，已得到广泛应用，但其价格昂贵。用胰蛋白酶代替胶原酶分离血管内皮细胞已有文献报道。
培养[2]
1. 人脐静脉内皮细胞原代培养
取正常妊娠足月分娩的新生儿脐带(至少长20cm)于无菌条件下剪去有钳夹痕和血肿、凝血块阻塞的部分，用磷酸盐缓冲液(PBS)洗净脐静脉内的血液，然后注入0.25%胰蛋白酶和0.1%胶原酶混合消化液(1∶1)使血管充盈，37℃孵育10～15min。收集脐静脉内液体，离心后用M199完全培养基制成细胞悬液，按1×106个细胞瓶接种于50cm2培养瓶中，置于37℃、5%CO2、饱和湿度培养箱中培养。6～12h后第1次换液，以后每2～3天换液1次。大约1周左右长成单层细胞。
2. 内皮细胞的传代培养
待细胞生长融合成单层并长满瓶壁后弃去培养瓶中的培养液，用D-Hanks液洗涤瓶壁数次，用自制的灭菌橡皮小铲在长有细胞的培养瓶表面轻轻推划，使细胞脱壁悬浮在少量培养液中，用吸管轻轻吹打均匀成为细胞悬液，按1∶2比例将细胞悬液接种于培养瓶中，进行传代培养。
3. 鉴定
1）培养细胞的形态学观察 相差显微镜下观察原代和传代细胞的形态。
2）培养细胞的超微结构观察 原代和传代内皮细胞按透射电镜常规方法制片观察超微结构。
3）培养细胞Ⅷ因子相关抗原的检测 酸化处理的普通盖玻片消毒后放入6孔培养板，将原代和传至第3代的内皮细胞悬液接种于盖玻片上，放入5%CO2培养箱中，37℃培养。待细胞均匀铺满孔底吸出培养液，用PBS冲洗盖玻片，冷风吹干后-20℃低温冰箱中冻存，标记链霉素抗生物素-生物素法(LSAB法)检测内皮细胞特有的Ⅷ因子相关抗原。
4. 结果
1）细胞数量
用全胶原酶消化，1根20cm左右的脐带收获的细胞可接种50cm2的培养瓶2瓶，用胰蛋白酶+胶原酶混合消化收获的细胞可接种50cm2的培养瓶2瓶，但密度稍低于全胶原酶。
2）培养细胞的形态学观察
相差显微镜下，人脐带培养细胞为单层，互不重叠，呈铺路石状镶嵌排列。细胞为扁平多角形，边界清楚，胞浆丰富。细胞核为圆形或椭圆形，核内染色质稀疏空亮，核仁1～2个(图1)。原代培养时，细胞接种后2h开始贴壁生长，传代培养时30min即开始贴壁生长。开始细胞呈圆形，逐渐变为多角形或长多角形，细胞间相互连接。传代细胞较原代生长旺盛，可见多个双核及核分裂细胞，有时可见多核及巨细胞。细胞传至6～7代时，细胞数目减少，细胞变性变形，最后不形成单层，脱落，不能继续生长。
3）人脐静脉内皮细胞的超微结构
透射电镜下，细胞呈多角形或短梭形，表面有绒毛。有较多的胞浆空泡，线粒体形状不规则，有较长的细丝束并与胞膜相连。可见游离的核糖体、粗面内质网、高尔基体及溶酶体。有的胞浆内可见内皮细胞特有的结构Weibel-Palade小体(W-P小体)，其横切面呈圆形或椭圆形，周围有膜包被，其中可见小管状结构(图2)。
4）原代及传代血管内皮细胞中Ⅷ因子相关抗原的检测经LSAB染色后镜下可见大量呈长梭形、胞浆棕色淡染的细胞，证实原代及传代培养的细胞为血管内皮细胞(图3)。
主要参考资料
[1] 现代药学名词手册
[2] 人脐静脉内皮细胞的培养与鉴定