背景[1-3]
KDEL抗体是一种可以特异性结合KDEL的人工合成抗体，可以靶向结合人、小鼠、大鼠和猪样品中的KDEL蛋白。KDEL抗体可用于多种科学应用，包括Western Blot、免疫组织化学、免疫细胞化学、免疫沉淀和ELISA。
KDEL抗体可作为非偶联的抗KDEL ER标记抗体使用。内质网（ER）中的错误折叠蛋白会引发ER应激反应。ER伴侣蛋白和错误折叠的蛋白会退出分泌途径并被回收至ER，在此过程中，KDEL ER标签发挥着重要作用。KDEL代表ER C端四肽滞留信号（Lys-Asp-Glu-Leu）。这种特定的标签会阻止蛋白质的分泌。这些蛋白质的ER滞留是通过一种途径实现的，该途径涉及通过KDEL标签将逃逸的蛋白质与ER后区室中的KDEL受体结合。然后，蛋白质-受体复合物被运送回ER。KDELR2是在高尔基体和ER之间循环的受体之一，将含有KDEL信号的蛋白质返回ER。这在研究环境中可能是有用的，因为含有KDEL ER滞留信号的目标蛋白质可以与KDELR2共表达，并且会被重新分布到ER。
KDEL抗体
KDEL抗体使用步骤（Western Blot）：
1.样本制备
1）融解RIPA裂解液（RIPA裂解液-细胞/组织裂解液缓冲液），混匀。
2）贴壁细胞：去除培养液，用PBS、生理盐水或无血清培养液洗一遍。加入150-250μL裂解液的比例加入裂解液。
3）充分裂解后，10000-14000g离心3-5min，取上清，即可进行后续的PAGE、Western和免疫沉淀等操作。
2.蛋白电泳
1）取出预制胶，将预制胶固定在电泳槽中，内槽加满tris-glycine电泳缓冲液。
2）在室温或不超过37℃的水浴中溶解5XSDS-PAGE上样缓冲液。水浴溶解后立即室温存放。
3）混合蛋白样品和5XSDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
4）100℃或沸水浴加热3-5min，以充分变性蛋白，之后冷却至室温备用。
5）上样蛋白，并在1个孔中上样蛋白marker，盖上电泳槽盖，打开电源，电泳至蓝色染料到达胶的底端处附近即可停止电泳。
6）电泳后取出胶板，用刀在侧边硅胶处，沿着两片玻璃缝隙切开硅胶，即可打开玻璃板；取胶时。
3.转膜与封闭
1）将胶浸于预冷的转膜缓冲液中平衡5min。
2）依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入预冷的转膜缓冲液中平衡10min，如用PVDF膜，需参照说明书，先用纯甲醇浸泡1-2min，再孵育于预冷的转膜缓冲液中。
3）装配转移三明治：海绵/3层滤纸/胶/膜/3层滤纸/海绵，每层放好后，用试管赶尽气泡。
4）将转移槽置于冰浴中，放入三明治，膜靠近阳极，胶靠近阴极，加入转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
5）转膜结束后，切断电源，取出膜。
6）将膜浸没在5mL丽春红染色液中，置于轨道摇床上室温染色5~10min或更长，直待膜上显示出蛋白条带。
7）清洗：取出膜，用蒸馏水，PBS或者其他适当溶液冲洗至背景清晰后拍照，大概冲洗2~3次，每次5min。
8）脱色：将膜放到0.1N NaOH溶液漂洗5min；倒去洗脱液，再重复一次。
9）清洗：再用蒸馏水清洗膜2~3次，每次5min。
10）将膜置于25mL封闭缓冲液中，在室温下孵育1小时。
11）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
4.抗体孵育与检测
1）将膜和一抗（KDEL抗体按照产品应用推荐稀释度）置于10mL一抗稀释缓冲液中在4℃下孵育过夜并不时轻轻晃动。
2）用5mL TBST洗涤三次，每次15min以去除残留的一抗(KDEL抗体)。
3）将膜和二抗（按照产品应用推荐稀释度）置于10mL封闭缓冲液中孵育1-2小时并不时轻轻晃动。
4）用5mL TBST洗涤三次，每次15min。
5）最后一次洗膜的同时，按照ECL超敏试剂盒说明书，新鲜配制发光工作液。
6）用平头镊取出膜，搭在滤纸上沥干洗液。将膜完全浸入发光工作液中，与发光工作液充分接触。室温孵育3min，准备立即压片曝光。但勿洗去发光液。
7）显影曝光。
应用[4][5]
KDEL抗体可以用于重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL对胃癌细胞增殖及凋亡的影响
通过选择正常胃粘膜细胞GES-1及两株胃癌细胞株MKN-45及SGC7901[3],观察重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL对胃癌细胞增殖及凋亡的影响,为c-Met阳性肿瘤的治疗提供实验依据。
观察重组免疫毒素（IT）抗c-Met/PE38KDEL对胃癌细胞的增殖抑制作用并探讨其作用机制,为胃癌的导向治疗奠定基础。
方法通过KDEL抗体Western Blot检测胃癌细胞MKN-45及SGC7901及正常胃黏膜细胞GES-1 c-Met的表达情况;分别用不同浓度IT处理胃癌细胞MKN-45及SGC7901及正常胃黏膜细胞GES-1,CCK-8试剂盒检测24、48h细胞增殖抑制率;[3H]-亮氨酸掺入法测定重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL对三种细胞5、24h蛋白合成抑制的影响;通过流式细胞术检测细胞凋亡及细胞周期的变化;Caspase试剂盒检测不同浓度重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL作用于细胞后caspase-3、caspase-8活性变化;最后通过Western Blot进一步检测caspase-3活性的变化。
结果1.通过KDEL抗体Western blotting检测胃癌细胞MKN-45,SGC7901及正常胃黏膜细胞GES-1的c-Met的表达情况发现胃癌细胞MKN-45,SGC7901比正常胃黏膜细胞GES-1的c-Met的表达量高,有显著性差异（P<0.01）;2.经不同浓度重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL作用后,两株胃癌细胞的增殖率及蛋白合成都有明显的降低,呈时间和剂量依赖性,当重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL浓度为10 ng/ml与100 ng/ml时,对两株细胞的增殖率及蛋白合成抑制作用最强（P<0.01）;3.流式细胞学显示,随着重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL浓度的增加,两株胃癌细胞凋亡率逐渐升高,MKN-45和SGC7901两株细胞在重组免疫毒素抗c-Met/PE38KD浓度为50 ng/ml时凋亡率分别为19.19%（P<0.01）及27.37%（P<0.01）;4.caspase活性测定显示,对照组相比,重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL浓度为100ng/ml时两株胃癌细胞caspase-3都有显著增高（P<0.05）,但caspase-8升高不如caspase-3显著,说明caspase-3在重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL诱导胃癌细胞凋亡的过程中可能发挥更为重要的作用。
参考文献
[1]Sea anemone cytolysins as toxic components of immunotoxins[J].Mayra Tejuca;;Gregor Anderluh;;Mauro Dalla Serra.Toxicon,2009(8)
[2]Higher cytotoxicity of divalent antibody-toxins than monovalent antibody-toxins[J].JaeSeon Won;;PilWon Nam;;YongChan Lee;;MuHyeon Choe.Biochemical and Biophysical Research Communications,2009(1)
[3]Removal of B cell epitopes as a practical approach for reducing the immunogenicity of foreign protein-based therapeutics[J].Satoshi Nagata;;Ira Pastan.Advanced Drug Delivery Reviews,2009(11)
[4]Recombinant Immunotoxins Containing Truncated Bacterial Toxins for the Treatment of Hematologic Malignancies[J].Robert Kreitman.BioDrugs,2009(1)
[5]徐伟.重组免疫毒素抗c-Met/PE38KDEL对胃癌细胞增殖及凋亡的影响[D].南京医科大学,2011.