背景[1-6]
小鼠组织直接PCR试剂盒是一款可快速对小鼠鼠尾、鼠耳、肌肉等组织样本进行PCR扩增的试剂盒。本试剂盒采用独特的裂解缓冲液体系,可以快速的裂解样品并释放出基因组DNA,不需要除去蛋白、RNA等,即可将释放出的基因组DNA作为模板直接用于PCR反应。此外,样品使用量少,低至5mg小鼠组织或2-5mm鼠尾即可进行实验。
小鼠组织直接PCR试剂盒中提供的2×Mouse Master Mix具有很强的扩增兼容性,能直接以待测样品裂解液为模板,进行高效特异性扩增。该试剂为2倍浓缩PCR反应混合液,包含了用于PCR扩增除模板和引物外的所有组分,大大简化操作过程,降低污染几率。
操作方法:样品基因组DNA释放
1.在离心管中加入100μL Buffer MP,4μL Protease Plus,轻轻涡旋混匀。
【注】:Buffer MP与Protease Plus混合后尽快使用,不宜长期保存。
2.取5-10mg动物组织或2-5mm鼠尾,置于上述离心管中,轻轻涡旋混匀。
【注】:组织应尽量剪碎,以便酶解反应更顺利进行。
3.65℃孵育10-30min,然后95℃处理5min。
【注】:65℃孵育,一般10min即可满足多数PCR需求。若需要的DNA量较大或样品较难酶解,可将时间延长至30min。组织块不需完全酶解,残余的部分在后续离心步骤中可被除去。
4.12000rpm离心5min。
5.将上清转移至新的离心管,4℃或-20℃保存或直接用于PCR扩增。
对照反应:
在PCR结果分析时,不管是阳性结果或阴性结果,如果没有对照反应,都不能确定结果是否可靠。为了便于后续实验结果的分析,建议在进行PCR时,设置阳性和阴性PCR对照反应以便于排除假阳性或假阴性的干扰。
注意事项:
1.为了避免样本间交叉污染,每次取样后都需要将取样器材的刃口或与样本直接接触的部位浸入2%次氯酸钠溶液中,反复洗刷数次进行清洗,然后用干净的纸巾擦干残余液体后再进行使用。为了试验方便,也可准备多个取样器材,在使用完后进行统一清洗,确保每一单独样本均使用的是无污染的取样器材。
2.建议使用新鲜采取的动物组织,若为长期冷冻组织,应尽量避免反复冻融,否则会导致模板的降解,影响PCR效率。
3.试剂Buffer MP若低温保存,易产生沉淀。在使用前务必将其在室温中放置一段时间,也可在37℃水浴中预热10min,以溶解沉淀,混匀后再使用。
4.电泳检测时,切勿使用含有SDS的Loading Buffer。否则,电泳时会在泳道中出现一大团拖尾亮带,影响实验结果。
5.为了安全和健康,请穿实验服并佩戴一次性手套操作。
应用[7][8]
小鼠组织直接PCR试剂盒可用于小鼠组织快速PCR检测:
小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因检测方法、GPV的VP3基因疫苗及GPV弱毒疫苗免疫小鼠以后在机体分布及表达等开展了以下研究:
①特异性检测小鹅瘟病毒(GPV)VP3基因的荧光定量PCR(FQ-PCR)的建立;②将GPV-VP3基因疫苗(pcDNA-GPV-VP3)分别以每只200μg、100μg、50μg肌肉注射和6μg、3μg、1μg基因枪轰击的方法免疫六组BALB/c小鼠;将GPV弱毒疫苗以每只100μl通过肌肉注射免疫一组BALB/c小鼠,免疫后不同时间分别取各组小鼠的心、肝、脾、肺、肾、脑、肠、胃和免疫部位组织(肌肉或皮肤)等组织器官,通过建立的FQ-PCR和免疫组织化学方法检测pcDNA-GPV-VP3及其表达产物和GPV弱毒在BALB/c小鼠体内的动态分布。
获得如下结果:
1.建立的FQ-PCR特异性强、灵敏度高、重复性好,核酸模板数与FQ-PCR测定的Ct值具有很好的直线相关性(相关系数达到0.999)。
2.pcDNA-GPV-VP3免疫小鼠后1-3h后可分布至小鼠体内各组织器官中且含量达到,随后含量下降,但仍能持续存在31wk以上。
3.在肌肉注射pcDNA-GPV-VP3三组中,基因疫苗的剂量和基因疫苗在组织中的含量呈现正相关性,15wk前差异显著(P<0.05),但15wk后差异不显著(P>0.05);在基因枪轰击pcDNA-GPV-VP3三组中,基因疫苗的剂量和基因疫苗在组织中的含量呈现较弱的正相关性,各剂量之间差异不显著(P>0.05)。
4.在肌肉注射pcDNA-GPV-VP3三组中,表达产物在心、免疫部位肌肉、肾和肝细胞细胞核中被检测到,基因疫苗的剂量和表达产物的量呈现一定的正相关性;基因枪轰击pcDNA-GPV-VP3三组中,表达产物在心、免疫部位皮肤、肾和肝细胞细胞核中被检测到,基因疫苗的剂量和表达产物的量呈现较弱的正相关性。
参考文献
[1]An Overview of Real-Time Quantitative PCR: Applications to Quantify Cytokine Gene Expression[J] . Annapaula Giulietti,Lut Overbergh,Dirk Valckx,Brigitte Decallonne,Roger Bouillon,Chantal Mathieu. Methods . 2001 (4)
[2]Stable Expression of a Foreign Gene, Delivered by Gene Gun, in the Muscle of Rainbow Trout Oncorhynchus mykiss[J] . Jong-Young Lee,Ikuo Hirono,Takashi Aoki. Marine Biotechnology . 2000 (3)
[3]DNA vaccines: safety and efficacy issues[J] . Dennis M. Klinman,Mitsuhiro Takeno,Motohide Ichino,Mili Gu,Galina Yamshchikov,Gil Mor,Jacqueline Conover. Springer Seminars in Immunopathology . 1997 (2)
[4]Gene gun-based nucleic acid immunization: elicitation of humoral and cytotoxic T lymphocyte responses following epidermal delivery of nanogram quantities of DNA[J] . Tamera M. Pertmer,Michael D. Eisenbraun,Dennis McCabe,Sudhirdas K. Prayaga,Deborah H. Fuller,Joel R. Haynes. Vaccine . 1995 (15)
[5]The Fate of Plasmid DNA After Intravenous Injection in Mice: Involvement of Scavenger Receptors in Its Hepatic Uptake[J] . Kenji Kawabata,Yoshinobu Takakura,Mitsuru Hashida. Pharmaceutical Research . 1995 (6)
[6] Targeted delivery of plasmid DNA to hepatocytes in vivo: optimization of the pharmacokinetics of plasmid DNA/galactosylated poly(L-lysine) complexes by controlling their physicochemical properties. Nishikawa M,Takemura S,Takakura Y, et al. Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics . 1998
[7] Plasmid DNA malaria vaccine: tissue distribution and safety studies in mice and rabbits. Parker S E,Borellini F,Wenk M, et al. Human Gene Therapy . 1999
[8]刘晓东. 小鹅瘟病毒VP3基因疫苗在小鼠体内动态分布与表达的研究[D].四川农业大学,2007.