背景[1-6]
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,12-well是浓度10%聚丙烯酰胺凝胶，可将各种蛋白质重复分离成具有两倍负载能力的良好分辨的条带。Novex Tris-Glycine Mini Gels基于传统的Laemmli蛋白电泳，可以使用Laemmli样品和运行缓冲液。
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format具有6％至18％的各种固定浓度，以及4-12％，4-20％，8-16％和10-20％范围的梯度。您可以从我们的许多井格式中进行选择，包括10孔，12孔和15孔以及不同的包装尺寸。
Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels,WedgeWell format,不含SDS，可用于以天然或变性形式运行蛋白质。对于变性蛋白质，建议使用Novex Tris-甘氨酸SDS样品缓冲液和Novex Tris-甘氨酸SDS运行缓冲液。对于天然蛋白质，建议使用Novex Tris-Glycine Native Sample Buffer和Novex Tris-Glycine Native Running Buffer。Novex 10%Tris-Glycine Mini Gels具有创新的楔形孔，其样品负载量比其他1.0 mm厚的凝胶多两倍。楔形井也有较大的开口，使样品装载更容易。
为了将蛋白质转移到膜上，建议在使用Invitrogen Mini Blot模块进行传统湿转移时使用Novex Tris-Glycine Transfer Buffer。也可以使用快速半干转移进行转移使用iBlot 2凝胶转移装置进行Invitrogen Power Blotter或快速干转移。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
应用[7][8]
用于重组ADAMTS13对脑出血后脑损伤和脑水肿的作用机制研究。
血管性血友病因子(von Willebrand factor vWF)是一种结构复杂的糖蛋白,在凝血和血栓中起重要作用,另外在炎症反应系统中VWF作为炎症介质能够通过促进炎症细胞的粘附、聚集进而促进炎症反应。有文献报道VWF基因敲除能够减少脑缺血后脑梗死体积。另外基础和临床研究表明蛛网膜下腔出血后血液中的vWF表达明显上调,vEF参与介导蛛网膜下腔出血后脑梗死和血管痉挛的发生,vWF高表达会导致脑出血病人预后不良。
ADAMTS13是vWF切割酶,vWF是目前已知ADAMTS13的唯一底物,ADAMTS13通过切割超聚化、功能超强的vWF使之成为分子量较小、活性较低的多肽,减少血栓形成和炎症反应,减少脑缺血和蛛网膜下腔出血后神经功能损伤。采用MCAO和ICH两种脑中风模型,检测这两种动物模型对血浆vWF表达量的影响,并进一步探讨vWF切割酶rADAMTS13对tPA引起的急性脑中风后溶栓性脑出血和脑出血后脑损伤和脑水肿的影响。
实验方法：课题整体分成两个部分,部分：重组ADAMTS13对脑出血后脑损伤和脑水肿的作用机制研究；第二部分：重组ADAMTS13通过vWF减少脑缺血后tPA引起的脑出血。
部分实验方法：
1.本实验采用二次注血法在小鼠纹状体中注入30μL自体血构建小鼠脑出血模型。
2.用ELISA方法测定脑出血24h后血液中vWF水平变化情况。
3.用H&E染色法测定脑出血72h后脑损伤体积。
4用干湿重法测定脑出血72h后脑组织含水量。
5.用fluoro-jade B染色法检测出血24h后血肿周边神经元变性情况。
6.注射Evans blue观察脑出血24h后血脑屏障通透。
7.用ELISA检测脑出血24h后IL-6表达情况。
8.用MPO活性测定法测定MPO活性
9.用免疫荧光技术测定脑出血24h后中性粒细胞浸润、小胶质细胞激活情况。
10.用Western Blot测定脑出血24h后ICAM-1,VCAM-1表达情况。
11.用明胶酶谱法测定脑出血后24h后MMP-9的活性。
实验方法：
1.本实验采用小鼠单侧大脑中动脉阻塞的方法(MCAO)建立局灶性缺血/再灌注模型。
2.首先我们使用ELISA法检测缺血造模后给予tPA导致的小鼠血浆vWF水平变化情况。
3.用紫外分光光度计测定不同处理组(vehicle、tPA、vWF、tPA+vWF、tPA+rATS、tPA+vWF+rATS)的脑出血量。
4.采用明胶酶谱法分析不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)MMP-9活性变化情况.
5.应用Western Blot方法检测不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)细胞核内NF-κB表达情况
6.用Western Blot方法测定不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)VEGF表达水平,利用免疫荧光法测定不同处理组(vehicle、tPA、rATS+tPA)VEGF与CD31+的共标数量。
7.利用Western Blot技术测定不同处理组(sham、vehicle、tPA、rATS+tPA)RhoA激活的水平,通过免疫荧光计数不同组(vehicle、tPA、rATS+tPA)RhoA-GFAP共标细胞的数量。
参考文献
[1]Effect of ADAMTS‐13 on cerebrovascular microthrombosis and neuronal injury after experimental subarachnoid hemorrhage[J].C.Muroi,M.Fujioka,K.Mishima,K.Irie,Y.Fujimura,T.Nakano,J.Fandino,E.Keller,K.Iwasaki,M.Fujiwara.J Thromb Haemost.2014(4)
[2]NLRP3 inflammasome contributes to inflammation after intracerebral hemorrhage[J].Qingyi Ma,Sheng Chen,Qin Hu,Hua Feng,John H.Zhang,Jiping Tang.Ann Neurol..2014(2)
[3]von Willebrand Factor:Form for Function[J].Andrew Yee,Colin Kretz.Semin Thromb Hemost.2013
[4]Inflammation in intracerebral hemorrhage:From mechanisms to clinical translation[J].Yu Zhou,Yanchun Wang,Jian Wang,R.Anne Stetler,Qing-Wu Yang.Progress in Neurobiology.2013
[5]Simvastatin Increases ADAMTS13 Expression in Podocytes[J].Lei Shen,Guoyuan Lu,Ningzheng Dong,Zhenni Ma,Changgeng Ruan.Thrombosis Research.2013(1)
[6]Variability in platelet‐and collagen‐binding defects in type 2M von Willebrand disease[J].D.M.Larsen,S.L.Haberichter,J.C.Gill,A.D.Shapiro,V.H.Flood.Haemophilia.2013(4)
[7]Endothelial Von Willebrand Factor Promotes Blood–Brain Barrier Flexibility and Provides Protection From Hypoxia and Seizures in Mice[J].Georgette L.Suidan,Alexander Brill,Simon F.De Meyer,Jaymie R.Voorhees,Stephen M.Cifuni,Jessica E.Cabral,Denisa D.Wagner.Arteriosclerosis,Thrombosis,and Vascular Biology.2013(9)
[8]蔡萍.重组ADAMTS13对脑出血后脑损伤和脑水肿的作用机制研究[D].复旦大学,2014.