α-淀粉酶(α-amylase,α-AL)试剂盒说明书
分光光度法 50管/24样
注 意:正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定
α-淀粉酶(α-amylase,α-AL)试剂盒测定意义:
淀粉酶负责水解淀粉,包括α-淀粉酶和β-淀粉酶。α-淀粉酶(EC 3.2.1.1)可随机地作用于淀粉中的α-1,4-糖苷键,生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖,同时使淀粉的粘度降低,因此又称为液化酶。
测定原理:
还原糖还原3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。β-淀粉酶不耐热,在70℃钝化15min,从而测定α-淀粉酶活性。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、玻璃比色皿、研钵和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
试剂一:25mL×1瓶,常温保存,若有黄色晶体析出,需90℃加热溶解后再用;
试剂二:20mL×1瓶,4℃保存,若有沉淀析出,需70℃加热溶解后再用。
α-淀粉酶(α-amylase,α-AL)试剂盒粗酶液提取:
组织:称取0.1~0.2g样本(建议称取约0.1g样本),加1 mL蒸馏水匀浆;将匀浆倒入离心管中,在室温下放置提取15min,每隔5min振荡1次,使其充分提取;3000g,25℃离心10min,吸取上清液并且加蒸馏水定容至10 mL,摇匀,即为淀粉酶原液。
血清(浆):直接检测。
操作步骤和加样表(在1.5mLEP管中依次加入下列试剂):
1、 分光光度计预热30min以上,调节波长到540 nm,蒸馏水调零。
2、 试剂一或试剂二40℃预热10min
3、测定步骤
70℃水浴15min左右,冷却
在40℃恒温水浴中准确保温5min
混匀,95℃水浴5min,冷却, 540nm处读取对照管和测定管吸光度,计算ΔA=A测定管-A对照管。
α-淀粉酶(α-amylase,α-AL)试剂盒活性计算:
1、标准条件下测定回归曲线为y=3.7215x -0.1778; x为标准品浓度(mg/mL),y为吸光值。
2、α淀粉酶活性
(1)按照样本质量计算
单位定义:每g组织每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活力单位。
α淀粉酶活性(mg/min/g鲜重)=[(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(W×V样÷V样总)÷T=1.075×(ΔA+0.1778)÷W
(2)按照蛋白质含量计算
单位定义:每mg组织蛋白每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷(V样×Cpr)÷T=0.1075×(ΔA+0.1778) ÷Cpr
(3)血清(浆)样本中α淀粉酶活性计算
单位定义:每mL血清(浆)每分钟催化产生1mg还原糖定义为1个酶活性单位。
α淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(ΔA+0.1778)÷3.7215×V反总]÷V样÷T=0.1075×(ΔA+0.1778)
V反总:反应体系总体积,0.5mL;V样:加入反应体系中样本体积,0.25 mL;V样总:提取液总体积,10 mL; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,5min。
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