背景[1-3]
HLEC细胞是衬覆于淋巴管内表面的一种单层扁平上皮，是构成淋巴管壁的主要结构，参与维持体液平衡，调节淋巴细胞再循环和机体的免疫反应和组织液及蛋白质的运输，在疾病过程中也起着重要作用。近年研究表明，人淋巴管内皮细胞还在伤口愈合、淋巴管水肿和炎症扩散等病理过程中起重要作用，而且与肿瘤转移密切相关。
内皮细胞系指血管、淋巴管的内膜上皮将内腔面覆盖的细胞。多数是单层扁平上皮属中胎叶性的上皮。血液循环和组织中大单核的游走的吞噬细胞有人认为是来自增生的血管内皮。
人淋巴管内皮细胞分离自淋巴管组织；淋巴管是淋巴液流经的管道。最小的淋巴管称毛细淋巴管，起始于盲端。人体除中枢神经、表皮、眼球的晶状体、角膜和内耳以外，全身都有分布。淋巴毛细管逐级汇合形成小、中、大淋巴管，最后形成两条总淋巴管：右淋巴导管和胸导管。
前者收集右半胸、右侧上肢和头颈右侧半的淋巴入右侧静脉角，后者收集下肢、腹部、左半胸、左侧上肢和头颈左侧半的淋巴入左侧静脉角。淋巴管中途还通过淋巴结。淋巴管壁薄，压力低。毛细淋巴管的壁为单层扁平内皮细胞，通透性大。大淋巴管壁有平滑肌，受交感神经支配，能作主动收缩。淋巴管内有瓣膜，能防止淋巴倒流。局部淋巴管因病变而阻塞时，组织液积聚，可出现局部水肿。
应用[4][5]
用于Fucoidan下调HLEC细胞中VEGFR3和PROX1的表达抑制淋巴管新生及机制研究
在淋巴管新生的过程中,淋巴管特异性标志物同源异形盒蛋白(PROX1)与血管内皮细胞生长因子受体3(VEGFR3)为主要调节因子。同源转录因子PROX1调控胚胎发育过程中淋巴管系统的发育和分化,维持淋巴管系统形成。激活VEGFR3及其配体血管内皮生长因子C(VEGF-C),诱导淋巴管内皮细胞(LECs)的增殖和迁移,并调节淋巴管新生。
NF-кB/PI3K/Akt信号通路主要促进细胞粘附,增殖,转移和细胞外基质降解,通路上的靶蛋白的激活,对肿瘤的发生和发展具有促进的作用。利用实验室前期工作纯化后的fucoidan,以人淋巴内皮细胞HLEC细胞系为研究对象,采用细胞生物学、分子生物学及动物肿瘤模型探究fucoidan对肿瘤淋巴管新生的抑制作用,并且深入研究fucoidan抗淋巴管新生的作用机制和相关信号通路。
方法:1.mtt法检测fucoidan对hlec细胞生长活力的影响,fucoidan对hlec细胞周期的作用是通过流式细胞术检测,westernblot检测细胞周期相关蛋白cdk4和cyclind1的表达水平。
2. 采用transwell小室法检测fucoidan对hlec迁移能力,并且利用细胞划痕实验检测fucoidan对不同时间点hlec细胞迁移过程的影响。
3. 体外实验检测fucoidan对hlec成管能力的影响。
4. 利用细胞骨架检测fucoidan对hlec细胞骨架结构的影响。
5. 细胞免疫荧光技术及rt-pcr方法检测fucoidan对hlec细胞中vegfr3蛋白及mrna的表达影响,并采用westernblot检测vegfr3及prox1的表达水平及nf-кb/pi3k/akt信号通路的影响。
6. 利用transwell小室共培养方法检测fucoidan对mhcc97h与hlec共培养下,hlec细胞淋巴管状结构形成能力的影响。
7.利用淋巴道高转移hca-f细胞株建立小鼠肿瘤模型,通过对小鼠肿瘤组织的双标免疫荧光法检测fucoidan对淋巴管密度(lvd)的影响,并检测小鼠瘤重。
参考文献
[1]Structural characterization and effect on anti-angiogenic activity of a fucoidan from Sargassum fusiforme[J].Qifei Cong,Huanjun Chen,Wenfeng Liao,Fei Xiao,Peipei Wang,Yi Qin,Qun Dong,Kan Ding.Carbohydrate Polymers.2016
[2]Tumor lymphangiogenesis and new drug development[J].Lothar C.Dieterich,Michael Detmar.Advanced Drug Delivery Reviews.2015
[3]Cell-based approach for 3D reconstruction of lymphatic capillaries in vitro reveals distinct functions of HGF and VEGF-C in lymphangiogenesis[J].Laure Gibot,Todd Galbraith,Bryan Kloos,Suvendu Das,Dan A.Lacroix,Fran?ois A.Auger,Mihaela Skobe.Biomaterials.2015
[4]Class 3 semaphorins negatively regulate dermal lymphatic network formation[J].Yutaka Uchida,Jennifer M.James,Fumikazu Suto,Yoh-suke Mukouyama.Biology Open.2015(9)
[5]杨亚宗.Fucoidan下调HLEC细胞中VEGFR3和PROX1的表达抑制淋巴管新生及机制研究[D].大连医科大学,2016.