背景[1-3]
小量DNA产物纯化试剂盒采用新型硅基质膜技术和试剂配方，通过离心吸附柱快速简单的结合-洗涤-洗脱三步即可从PCR产物或酶反应液(酶切，连接，探针标记等)中纯化回收100 bp-10 kb的DNA片段，每个吸附柱最高可吸附10μg的DNA，同时限度的去除引物、寡核苷酸、酶等杂质。纯化回收的DNA纯度及浓度高，完整性好，回收率高，可直接用于测序、连接和转化、标记、体外转录等分子生物学实验。
DNA产物纯化胶图
操作步骤：
1、估计DNA反应液的体积，加入5倍体积的Buffer PB，充分混匀(无需去除石蜡油或矿物油)。
注意：1)如DNA反应体系为50μl(不包括石蜡油体积)，则加入250μl Buffer PB。
2)在加入Buffer PB后检测溶液的pH值，若pH值＞7.5，可向其中加入10-30μl的3 M醋酸钠(pH5.0)，从而将pH值调到5-7。
2、柱平衡：向已装入收集管中的吸附柱DM中加入200μl Buffer PS，13000rpm(~～～16200×g)离心1分钟，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
3、将步骤1中所得溶液加入到已装入收集管的吸附柱中，室温放置1分钟，13000rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：吸附柱容积为750μl，若样品体积大于750μl可分批加入。
4、向吸附柱中加入500μl Buffer PW(使用前请先检查是否已加入无水乙醇)13000rpm离心30-60 s，倒掉收集管中的废液，将吸附柱放回收集管中。
注意：如果纯化的DNA用于盐敏感实验(例如平末端连接实验或直接测序)，建议加入Buffer PW后静置2-5分钟再离心。
5、13000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。将吸附柱置于室温数分钟，以彻底晾干。
6、将吸附柱放到一个新离心管(自备)中，向吸附膜中间位置悬空滴加30-50μl Buffer EB，室温放置1分钟。13000rpm离心1分钟，收集DNA溶液。-20℃保存DNA。
应用[4][5]
用于人原代淋巴细胞CRISPR基因编辑的初步探讨研究
利用目前高效快捷的CRISPR技术对体外培养的人原代淋巴细胞进行PD-1和CTLA-4基因双敲除方法:
一. 通过针对CTLA-4基因和PD-1基因各设计了三组候选sgRNA序列,并据此构建CRISPR-CTLA-4和CRISPR-PD-1敲除质粒。使用293淋巴细胞系验证了各个sgRNA的编辑效率。将对CTLA-4和PD-1基因编辑最高的两个sgRNA构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒。
二. 使用电穿孔的方法,尝试将CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒转染到人原代淋巴细胞中。为了达到电穿孔转染原代淋巴细胞的标准,对电穿孔的各种条件进行了摸索与优化。
三. 利用PCR扩增的方法,从CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒中扩增达到CTLA-4-PD-1片段,将此片段连接到腺病毒表达载体上,以尝试通过构建CRISPR-CTLA-4-PD-1腺病毒感染人原代淋巴细胞。
四. 利用构建靶向CTLA-4和PD-1基因的CRISPR/RNP蛋白复合物,使用已经优化好的电穿孔条件将其电穿孔转染到人原代淋巴细胞中,并观测转染后基因编辑的情况和改造后淋巴细胞对K562细胞系的杀伤效果。
结果:成功构建CRISPR-CTLA-4-PD-1双敲除质粒,并且验证了其在293细胞中能正常发挥基因编辑作用。对原代淋巴细胞电穿孔条件的建立,且对电转各个因素进行较为全面的分析,发现了不同的电压、脉冲时间、电转缓冲液、细胞培养状态,质粒大小与纯度对转染效率和细胞活率都有显著影响。其中,阳性GFP质粒电穿孔转染人原代淋巴细胞转染效率为34.5%。
参考文献
[1]CRISPR-Cas9-mediated multiplex gene editing in CAR-T cells.Liu,X,Zhang,Y,Cheng,C,Cheng,A.W,Zhang,X,Li,N,Xia,C,Wei,X,Liu,X,Wang,H.Cell Research.2017
[2]Cationic lipid-mediated delivery of proteins enables efficient protein-based genome editing in vitro and in vivo.Zuris,J.A,Thompson,D.B,Shu,Y,Guilinger,J.P,Bessen,J.L,Hu,J.H,Maeder,M.L,Joung,J.K,Chen,Z.Y,Liu,D.R.Nature Biotechnology.2015
[3]Development of adenovirus vectors for the expression of heterologous genes.Berkner K L.Biotechniques.1988
[4]Plasmid DNA Size Does Affect Nonviral Gene Delivery Efficiency in Stem Cells.Sofia Ribeiro,Juergen Mairhofer,Catarina Madeira.CELLULAR REPROGRAMMING.2012
[5]孔明圣.人原代淋巴细胞CRISPR基因编辑的初步探讨[D].广东药科大学,2019.