背景[1-3]
聚糖对氨基苯甲酰胺(2-AB)荧光标记试剂盒通过荧光探针对氨基苯甲酰胺和还原性糖分子的末端羧基碳的结合，进而化学还原而产生的标记糖分子，来识别和定量糖分子成分和丰度的权威而经典的技术方法。该技术经过精心研制、成功实验证明的。主要适用于各种寡聚糖的标记制备。产品即到即用，操作简捷，性能稳定，荧光清晰，高度敏感。
聚糖对氨基苯甲酰胺(2-AB)荧光标记
聚糖（glycan）是一种缺乏可见光或紫外光吸收特性的生物大分子，因此使用相应的标记分子成为聚糖分子敏感定量检测分析所必需。运用还原性氨基反应化学（amination chemistry），将释放出的聚糖分子游离还原末端，标记上荧光探针，以达到纯化分离、识别和定量的目的。对氨基苯甲酰胺（2-aminobenzamide；2-AB）是一种荧光标记分子，分子量为136.15，具有紫外（330nm波长）吸收性和荧光特性（激发波长320nm，散发波长420nm）。
在标记糖分子中，为非特异性，超敏感（皮摩尔级）、确保糖分子结构完整性和稳定性。标记效率可达85%。首先糖分子处于一种还原形态，染料的胺基团与糖分子的羧基碳之间反应，产生亲核性schiff碱配体结构。然后通过化学还原剂进行还原，而获得标记。
应用[4][5]
用于基于红色荧光蛋白二聚体的N-糖酰胺酶活性检测方法研究
利用定点突变将N-糖基化位点引入ddRFP,突变体在大肠杆菌里（无糖基化系统）共表达后获得红色荧光二聚体;继而建立酵母表达系统（有糖基化系统）对该蛋白进行表达,获得糖基化蛋白产物;将目的蛋白做体外混合实验,通过测定混合物去糖基化后的荧光强度变化检测PNGase的活性。
结果如下:1.ddRFPA1、ddRFPB1的定点突变和突变体共表达根据ddRFPA1、ddRFPB1的基因序列设计含有突变位点的引物,突变位点分别为Lys139A、Tyr146A、Phe178A、Va1196A、Glu160B、Va1196B突变为Asn,Va1176A、Glu1O1B突变为Ser。结果成功获得RFP139A、RFP146A、RFP176A、RFP178A、RFP196A、RFP196B突变体,RFP101B、RFP160B突变失败。将野生型ddRFPA1和突变型A（所有ddRFPA1的突变体）分别转化至含有ddRFPB1、RFP196B基因的BL21感受态细胞中,表达结果显示:在BL21细胞中形成了ddRFPA1/ddRFPB1、ddRFPA1/RFP196B、RFP139A/RFP196B共3个二聚体,且这3个二聚体都能发出明亮的红色荧光,与对照组单个ddRFPA1、ddRFPB1、RFP196B存在明显差异。
2. ddRFPA1、ddRFPB1及突变体的真核亚克隆与酵母表达ddRFPA1、ddRFPB1及其突变体经引物设计、PCR扩增、连接到中间载体、酶切后连接至真核载体pPICZαB-H,以5AOX作为引物测序,所有基因均克隆成功。用醋酸锂法制备GS115酵母感受态细胞,将荧光蛋白基因与pPICZαB-H载体的重组质粒通过MSSI酶切线性化,后转化至酵母细胞获得成功转化子,转化子经扩大培养和表达培养一周后得到目的蛋白表达上清,预处理后经western blot验证,结果显示:ddRFPA1和ddRFPB1及其突变体能在酵母系统内成功表达,其表达蛋白与目的蛋白条带38kDa大小一致。
3.红色荧光二聚体在PNGase活性检测中的应用将第二章酵母表达上清预处理后,在96孔酶标板中分别将ddRFPA1和RFP196B各100 ul按1:1混合,将RFP139A和RFP196B各100 ul按1:1混合,加入PNGase酶,在荧光酶标仪内37℃孵育16 h,每2 h测定其荧光值（ex/em:535 nm/605 nm）。
参考文献
[1]A Fluorogenic Red Fluorescent Protein Heterodimer[J].Spencer C.Alford,Ahmed S.Abdelfattah,Yidan Ding,Robert E.Campbell.Chemistry&Biology.2012(3)
[2]N-glycoproteomics in plants:Perspectives and challenges[J].Wei Song,Maurice G.L.Henquet,Remco A.Mentink,Aalt Jan van Dijk,Jan H.G.Cordewener,Dirk Bosch,Antoine H.P.America,Alexander R.van der Krol.Journal of Proteomics.2011(8)
[3]Protein folding and quality control in the endoplasmic reticulum:Recent lessons from yeast and mammalian cell systems[J].Jeffrey L Brodsky,William R Skach.Current Opinion in Cell Biology.2011(4)
[4]Endoplasmic Reticulum Protein Quality Control and Its Relationship to Environmental Stress Responses in Plants[J].Liu,Jian-Xiang,Howell,Stephen H.Plant Cell.2010(9)
[5]厉单.基于红色荧光蛋白二聚体的N-糖酰胺酶活性检测方法研究[D].南京农业大学,2018.