背景[1-3]
HGC-27细胞源自未分化胃癌组织,能分泌粘液素。 HGC-27细胞属于上皮细胞样贴壁细胞,生长培养基:RPMI-1640+20%FBS+1%P/S,培养条件气相:空气,95%;CO2,5%;温度:37℃。
HGC-27细胞
培养操作
1)复苏细胞:将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻,加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜(或将细胞悬液加入10cm皿中,加入约8ml培养基,培养过夜)。第二天换液并检查细胞密度。
2)细胞传代:如果细胞密度达80%-90%,即可进行传代培养。
1.弃去培养上清,用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液(0.25%Trypsin-0.53mM EDTA)于培养瓶中,置于37℃培养箱中消化1-2分钟,然后在显微镜下观察细胞消化情况,若细胞大部分变圆并脱落,迅速拿回操作台,轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基,轻轻打匀后吸出,在1000RPM条件下离心4分钟,弃去上清液,补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1:2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
应用[4][5]
用于20(S)-原人参二醇型皂苷诱导HGC-27细胞死亡的自噬相关机制研究
以HGC-27细胞为实验对象,开展完成以下实验:(1)磺酰罗丹明B(SRB)法检测肿瘤细胞存活率;(2)Giemsa染色法观察细胞形态变化及胞质空泡的形成;(3)TUNEL染色法检测细胞凋亡;(4)Western Blot检测凋亡相关蛋白caspase3、自噬相关蛋白LC3与p62;(5)激光共聚焦显微镜免疫荧光共定位检测溶酶体膜完整性与pH变化;(6)高相液相色谱法(HPLC)检测胞内ATP、ADP、AMP含量并分析细胞能荷状态;(7)MitosoxTM Red荧光探针染色,流式细胞术检测线粒体活性氧;(8)JC-1探针染色,荧光显微镜检测线粒体膜电位;(9)透射电子显微镜(TEM)观察细胞器及自噬小体等亚结构。
结果:通过以上实验检测和分析,得到如下结果:(1)20(S)-原人参二醇型皂苷Rg3、Rh2及PPD均有抑制人胃癌HGC-27细胞增殖的作用,其中Rh2细胞毒作用最强(IC50=4.93±0.19μM),PPD次之(IC50=6.25±0.64μM),Rg3最弱(IC50=33.31±6.91μM);当处理浓度为9μM时,Rh2与PPD处理HGC-27细胞6h,可诱导细胞出现明显胞质空泡化现象,与对照组相比,空泡率差异具有统计学意义(p<0.01),而Rg3组未发现类似现象;
(2)TUNEL染色检测表明三种原人参二醇型皂苷均未诱导典型的细胞凋亡,同时未出现明显cleaved caspase-3的表达,广谱caspase抑制剂z-VAD-fmk对三种人参皂苷所致的细胞死亡无明显改善作用,凋亡并非主要的细胞死亡方式;
(3)Rh2与PPD均可诱导HGC-27细胞内LCⅡ蛋白上调,与对照组相比,差异具有统计学意义(p<0.01),而且在Rh2处理组中,p62蛋白显著积累(p<0.05);而Rg3处理组LCⅡ与p62蛋白均无明显变化;
参考文献
[1]Global cancer statistics 2018:GLOBOCAN estimates of incidence and mortality worldwide for 36 cancers in 185 countries[J].Freddie Bray BSc,MSc,PhD,Jacques Ferlay ME,Isabelle Soerjomataram MD,MSc,PhD,Rebecca L.Siegel MPH,Lindsey A.Torre MSPH,Ahmedin Jemal PhD,DVM.CA:A Cancer Journal for Clinicians.2018(6)
[2]Ginsenoside Rh2 inhibits proliferation and migration of medulloblastoma Daoy by down‐regulation of microRNA‐31[J].Yan Chen,Hong Shang,Shunli Zhang,Xiaohong Zhang.Journal of Cellular Biochemistry.2018(8)
[3]Functional mechanism of Ginsenosides on tumor growth and metastasis[J].Tianli Chen,Bowen Li,Ye Qiu,Zhidong Qiu,Peng Qu.Saudi Journal of Biological Sciences.2018
[4]Enhancement of oral bioavailability and immune response of Ginsenoside Rh2 by co-administration with piperine[J].Zhao-Hui JIN,Wen QIU,Hui LIU,Xue-Hua JIANG,Ling WANG.Chinese Journal of Natural Medicines.2018(2)
[5]韩晴晴.20(S)-原人参二醇型皂苷诱导HGC-27细胞死亡的自噬相关机制研究[D].烟台大学,2020.