背景[1-3]
人11,12-二羟二十碳三烯酸(11,12-DHETS)ELISA试剂盒是固相夹心法酶联免疫吸附法（ELISA）检测样本中11,12-二羟二十碳三烯酸(11,12-DHETS)的含量。
实验原理：已知待测物质浓度的标准品、未知浓度的样品加入微孔酶标板内进行检测。先将待测物质和生物素标记的抗体同时温育。洗涤后，加入亲和素标记过的HRP。再经过温育和洗涤，去除未结合的酶结合物，然后加入底物A、B，和酶结合物同时作用产生颜色。颜色的深浅和样品中待测物质的浓度呈比例关系。
人11,12-二羟二十碳三烯酸(11,12-DHETS)ELISA试剂盒
试剂盒使用步骤：
1）使用前，将有试剂充分混匀。不要使液体产生大量的泡沫，以免加样时加入大量的气泡，产生加样上的误差。
2）根据待测样品数量加上标准品的数量决定需的板条数。每个标准品和空白孔建议做复孔。每个样品根据自己的数量来定，能使用复孔的尽量做复孔。标本用标本稀释液1：1稀释后加入50ul于反应孔内。
3）加入稀释好后的标准品50ul于反应孔、加入待测样品50ul于反应孔内。立即加入50ul的生物素标记的抗体。盖上膜板，轻轻振荡混匀，37℃温育1小时。
4）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
5）每孔加入80ul的亲和链酶素-HRP，轻轻振荡混匀，37℃温育30分钟。
6）甩去孔内液体，每孔加满洗涤液，振荡30秒，甩去洗涤液，用吸水纸拍干。重复此操作3次。如果用洗板机洗涤，洗涤次数增加一次。
7）每孔加入底物A、B各50ul，轻轻振荡混匀，37℃温育10分钟。避免光照。
8）取出酶标板，迅速加入50ul终止液，加入终止液后应立即测定结果。
9）在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于谷氨酸调控脑CYPs介导的花生四烯酸代谢机制研究
究谷氨酸对脑CYP2J及其介导的EETs代谢产物的影响。
方法:采用人胶质母细胞瘤U251细胞系,给予不同浓度（10-50μM）谷氨酸处理24 h,利用定量RT-PCR检测mGluR5和CYP2J2 mRNA水平。采用mGluR5和MAPK（ERK,JNK,p38）特异性抑制剂预处理U251细胞系30 min,然后给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用定量RT-PCR检测CYP2J2 mRNA水平,考察mGluR5以及MAPK是否参与谷氨酸对CYP2J的调控作用。
给予MAPK特异性抑制剂预处理细胞30 min后,给予谷氨酸（50 μM）处理24 h,利用染色质免疫沉淀（ChIP）检测CREB与CYP2J启动子结合能力。在U251细胞系共转染CREB表达质粒及含CYP2J2启动子的荧光报告基因重组质粒,检测CREB对CYP2J2启动子的调控作用。
Wistar大鼠按照两雌一雄进行交配,待动物分娩后,将新生鼠随机分为对照组和谷氨酸处理组,于1、3、5、7 d皮下注射预先配制的谷氨酸溶液（4mg/g）。出生后10周,断头处死雄性动物,分离不同脑区（海马,小脑,额叶皮层,脑干）,测定不同脑区mGluR5和CYP2J2 mRNA水平,以及EETs和DHETs水平。
采用DMEM衍生化处理EETs和DHETs,制备不同代谢物各自的标准品。采用LC-MS/MS法检测不同脑区EETs和DHETs水平,并利用PLS-DA分析统计不同脑区代谢物的差异。结果:体外实验中,与对照组相比,谷氨酸呈时间及剂量依赖性调控CYP2J2mRNA水平。
给予MPEP预处理,可逆转谷氨酸对CYP2J2的诱导效应,提示mGluR5介导谷氨酸对CYP2J2的调控作用。与对照组相比,谷氨酸处理可以上调ERK1/2,p38和JNK磷酸化蛋白水平。U251细胞系分别给予ERK1/2（U0126）,p38（SB202190）,以及JNK（SP600125）的特异性抑制剂预处理30min后,能明显拮抗谷氨酸上调CYP2J2mRNA的诱导效应。
染色体免疫共沉淀实验发现,谷氨酸（50μM）可增加CREB与CYP2J2启动子的结合,较对照组上升1.78倍。然而,给予ERK1/2（U0126）,p38（SB202190）,JNK（SP600125）特异性抑制剂可抑制 CREB与CYP2J2启动子的结合。在整体动物实验中,初生小鼠给予谷氨酸处理,可使得成年动物mGluR5水平在额叶皮层、海马、小脑、脑干分别上调1.49倍,3.82倍,1.46倍,1.41倍。
实验结果提示,幼年时期大剂量谷氨酸暴露,可导致mGluR5上调,进而引起谷氨酸系统的持续活化。同时,谷氨酸处理动物CYP2J3表达水平在额叶皮层、海马、小脑、脑干分别上调2.21倍,8.27倍,1.5倍和3.53倍。经PLS-DA分析,海马与小脑,额叶皮层和脑干的EETs和DHETs的代谢物含量有显著区别。
分别对不同脑区的EETs及DHETs进行了统计,幼年暴露谷氨酸可致成年动物额叶皮层、海马、小脑、脑干EETs和DHETs总量上调1.16倍,1.18倍,1.18倍和1.19倍。
参考文献
[1]Granular Layer Neurons Control Cerebellar Neurovascular Coupling Through an NMDA Receptor/NO-Dependent System[J] . Lisa Mapelli,Giuseppe Gagliano,Teresa Soda,Umberto Laforenza,Francesco Moccia,Egidio U. D’Angelo. Journal of Neuroscience . 2017 (5)
[2]Activation of type 5 metabotropic glutamate receptor promotes the proliferation of rat retinal progenitor cell via activation of the PI-3-K and MAPK signaling pathways[J] . Z. Zhang,F. Hu,Y. Liu,B. Ma,X. Chen,K. Zhu,Y. Shi,T. Wei,Y. Xing,Y. Gao,H. Lu,Y. Liu,Q. Kang. Neuroscience . 2016
[3]MAP Kinase Pathways: Molecular Roads to Primary Acral Lentiginous Melanoma[J] . Juliana D. Fernandes,Ricardo Hsieh,Luiz A. R. de Freitas,Miguel A. R. Brandao,Silvia V. Louren?o,Martin Sangueza,Marcello M. S. Nico. The American Journal of Dermatopathology . 2015 (12)
[4]Defects in 15-HETE Production and Control of Epithelial Permeability by Human Enteric Glial Cells From Patients With Crohn’s Disease[J] . Camille Pochard,Sabrina Coquenlorge,Julie Jaulin,Nicolas Cenac,Nathalie Vergnolle,Guillaume Meurette,Marie Freyssinet,Michel Neunlist,Malvyne Rolli-Derkinderen. Gastroenterology . 2015
[5]刘明周. 谷氨酸调控脑CYPs介导的花生四烯酸代谢机制研究[D].武汉大学,2017.