背景[1-3]
人解整合素样金属蛋白酶33(ADAM33)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织、细胞上清及相关液体样本中人解整合素样金属蛋白酶33（ADAM33）的含量。试剂盒性能：1.检测范围：0.5 ng/mL–16 ng/mL。2.灵敏度：低检测浓度小于0.1 ng/mL。
实验原理
试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人解整合素样金属蛋白酶33（ADAM33）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成终的黄色。颜色的深浅和样品中的人解整合素样金属蛋白酶33（ADAM33）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
样本处理及要求
1.血清：全血标本请于室温放置2小时或4℃过夜后于1000g离心20分钟，取上清即可检测，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于2-8°C 1000g离心20分钟，或将标本放于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
人解整合素样金属蛋白酶33(ADAM33)ELISA试剂盒
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
应用[4][5]
用于ADAM33表达调控对气道平滑肌力学行为影响及其机理研究
研究发现sADAM33超表达能够引起气道平滑肌基础刚度以及收缩能力的显著提升,并且能够增加平滑肌在的二维基底的划痕侧向迁移能力,降低其在Transwell中跨微孔的迁移能力,证实了ADAM33的表达确实会影响气道平滑肌的力学行为,但其机理并不清楚,而且ADAM33超表达对气道平滑肌其他重要力学行为如对周期性应变、短暂拉伸响应、迁移行为和粘附能力的影响还未知。因此本研究就ADAM33超表达对气道平滑肌收缩能力、短暂拉伸响应、粘附能力和迁移行为等力学行为的影响进行了进一步研究,并对其机理进行了初步探索,这对解释哮喘发病机理以及研究有效治疗手段提供了有利参考。
主要研究内容和结果如下:1)初步探索ADAM33表达影响ASMCs基础刚度、收缩能力的机制。脱血清培养48 h后sADAM33超表达显著上调了α-actin、calponin、SM-MHC这三种收缩态标志蛋白mRNA以及蛋白表达水平。进一步对ASMCs的Rho活性进行检测后发现sADAM33超表达导致pLV-ADAM33组的Rho-GTP占总Rho的比例比GFP组高一倍左右。当在培养基中加入ROCK抑制剂后发现sADAM33超标达所导致的这些调控几乎都被完全抑制了。这些研究结果表明sADAM33超表达会引起ASMCs收缩蛋白的过度积累而导致其处于超强收缩态,这一调控过程很大程度上依赖于Rho/ROCK信号通路介导。
另外,发现sADAM33超表达的ASMCs细胞的培养基中的sADAM33浓度显著升高,将该条件培养基用于培养对照组平滑肌后发现能引起其收缩蛋白表达量的增高,从而确认sADAM33可以作为可溶蛋白发挥作用。
2) ADAM33调控对ASMCs响应长期小幅拉伸及大幅短暂拉伸的影响并验证ADAM33是否是力敏感基因。经过48h、0.3Hz、5%的单轴拉伸后,sADAM33超表达会与周期性单轴应变加载产生协同作用而上调平滑肌收缩蛋白表达,特别是SM-MHC的表达。
3) 推测sADAM33超表达在哮喘患者气道周期性单轴应变的情况下,有可能更加促进平滑肌细胞肌球蛋白的表达以及肌球蛋白纤维的组装。促进较长的肌球蛋白纤维的形成,进而产生较大而且稳定的被动收缩,导致气道平滑肌变成收缩力更强紧张度更高的超强收缩态,从而促进AHR的产生。
参考文献
[1]Myosin filaments in smooth muscle cells do not have a constant length[J].Jeffrey C.‐Y.Liu,J?rg Rottler,Lu Wang,Jenny Zhang,Chris D.Pascoe,Bo Lan,Brandon A.Norris,Ana M.Herrera,Peter D.Paré,Chun Y.Seow.The Journal of Physiology.2013(23)
[2]ADAM33 protein expression and the mechanics of airway smooth musclecells are highly correlated in ovalbumin-sensitized rats[J].Feng Lin,Aijing Song,Jiamin Wu,Xuemei Jiang,Jiaoyue Long,Jun Chen,Yiyuan Duan,Yanling Shi,Linhong Deng.Molecular Medicine Reports.2013(4)
[3]Associations and interactions of genetic polymorphisms in innate immunity genes with early viral infections and susceptibility to asthma and asthma-related phenotypes[J].Denise Daley,Julie E.Park,Jian-Qing He,Jin Yan,Loubna Akhabir,Dorota Stefanowicz,Allan B.Becker,Moira Chan-Yeung,Yohan Bossé,Anita L.Kozyrskyj,Alan L.James,Arthur W.Musk,Catherine Laprise,Richard G.Hegele,Peter D.Paré,Andrew J.Sandford.The Journal of Allergy and Clinical Immunology.2012(6)
[4]Asthmatic airway hyperresponsiveness:the ants in the tree[J].Ynuk Bossé.Trends in Molecular Medicine.2012(11)
[5]段翼远.ADAM33表达调控对气道平滑肌力学行为影响及其机理研究[D].重庆大学,2016.