背景[1-3]
BRL 3A大鼠正常肝细胞是分离自SD大鼠正常肝组织的成纤维细胞样贴壁细胞。
BRL 3A大鼠正常肝细胞
培养步骤：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1、对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
3）细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，进行离心收集，1000RPM条件下离心8-10分钟，去除上清，按冻存数量加入血清及DMSO，冻存比例为90%FBS+10%DMSO。
应用[4][5]
用于迷迭香酸抑制丙烯酰胺诱导的氧化应激和内质网应激缓解BRL-3A细胞凋亡机制研究
对AA诱导的大鼠BRL-3A细胞毒性损伤的机制进行深入研究。通过添加天然植物源抗氧化剂Ros A,研究其对AA诱导的OS和ERS介导BRL-3A细胞凋亡的保护作用,为Ros A保护机体免受AA肝毒性的作用机制提供理论依据。
主要研究结果如下:（1）研究了Ros A对自由基的清除能力及其对AA诱导BRL-3A细胞氧化应激水平的影响。Ros A对ABTS、DPPH、FRAP和ORAC自由基有着很好的清除作用,而且清除作用呈明显浓度依赖性,Ros A浓度越高,其自由基清除效率越高。Ros A预处理可以降低AA刺激BRL-3A细胞产生的大量ROS,提高BRL-3A细胞SOD和GSH活性,降低MDA生成量,从而增强细胞的抗氧化能力,减轻AA诱导的细胞BRL-3A氧化应激损伤和脂质过氧化。
（2）研究了Ros A对AA诱导的BRL-3A细胞CYP2E1和MAPK信号通路的影响。Ros A通过疏水作用结合在CYP2E1的活性区域,与氨基酸残基Ile114、Trp122、Leu368、Phe430、Arg435、Cys437、Ala438和Gly439有较强的相互作用,并降低BRL-3A细胞中CYP2E1的蛋白表达,抑制CYP2E1蛋白活性。AA提高MAPK通路蛋白p-JNK、p-ERK和p-p38的表达水平,然而Ros A和NAC（ROS抑制剂）预处理显著降低p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白表达水平。表明Ros A可以通过减少ROS的产生抑制AA激活的MAPK通路,从而保护细胞免受AA诱导的OS损伤。
（3）研究了Ros A对AA诱导的BRL-3A细胞内质网应激和细胞凋亡的影响。Ros A预处理降低AA诱导产生的钙离子,维持细胞中钙离子动态平衡。Ros A降低IRE1α通路蛋白GRP78,p-IRE1α,TRAF2和XBP-1s的表达水平,并降低ERS介导凋亡相关蛋白P-ASK1,Caspase-12和CHOP的表达。NAC预处理后,ERS相关蛋白IRE1α,GRP78,TRAF2和CHOP的表达明显降低,表明Ros A可以通过减少ROS的产生抑制AA诱导的ERS反应,从而保护细胞免受AA诱导的ERS损伤。Ros A预处理显著降低AA提高的细胞凋亡率,并降低凋亡相关蛋白Caspase-3和Bax/Bcl-2的表达。NAC和4-PBA（ERS抑制剂）预处理降低细胞凋亡蛋白Caspase-3和Bax/Bcl-2的表达水平,表明Ros A通过抑制OS和ERS抑制细胞凋亡,从而预防AA的肝毒性。
综上所述,Ros A有着良好的自由基清除能力和抗氧化能力,有效降低AA诱导BRL-3A细胞产生的ROS和MDA含量,显著提高SOD和GSH活性,降低CYP2E1蛋白表达,从而改善细胞氧化损伤。Ros A通过降低p-JNK、p-ERK和p-p38蛋白表达抑制AA激活的MAPK通路,减轻AA诱导的细胞OS损伤。Ros A还通过维持钙离子动态平衡,抑制IRE1α通路蛋白减轻ERS损伤。此外,Ros A通过降低细胞凋亡率和凋亡相关蛋白的表达抑制AA诱导的细胞凋亡。总之,Ros A通过抑制OS和ERS减缓细胞凋亡,从而预防AA的肝毒性。
参考文献
[1]Reactive oxygen species rescue regeneration after silencing the MAPK–ERK signaling pathway in Schmidtea mediterranea[J].Jaenen V.,Fraguas S.,Bijnens K.,Heleven M.,Artois T.,Romero R.,Smeets K.,CebriàF..Scientific Reports.2021(1)
[2]Chemotherapeutic and prophylactic antimalarial drugs induce cell death through mitochondrial-mediated apoptosis in murine models[J].Drug and Chemical Toxicology.2021(1)
[3]Application of 1H-NMR combined with qRT-PCR technology in the exploration of rosmarinic acid biosynthesis in hair roots of Salvia miltiorrhiza Bunge and Salvia castanea f.tomentosa Stib[J].Hou Zhuoni,Li Yuanyuan,Su Feng,Chen Jipeng,Zhang Xiaodan,Xu Ling,Yang Dongfeng,Liang Zongsuo.Planta.2020(1)
[4]Effect of carnosic acid on acrylamide induced neurotoxicity:in vivo and in vitro experiments.[J].Ghasemzadeh Rahbardar Mahboobeh,Hemadeh Batool,Razavi Bibi Marjan,Eisvand Farhad,Hosseinzadeh Hossein.Drug and chemical toxicology.2020
[5]王明华.迷迭香酸抑制丙烯酰胺诱导的氧化应激和内质网应激缓解BRL-3A细胞凋亡机制研究[D].吉林大学,2021.