背景[1-3]
人胰脂肪酶(PL)ELISA试剂盒是用ELISA法定量测定人血清、血浆或其它相关生物液体中PL含量。
实验原理：用纯化的PL抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的PL抗体、HRP标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的PL呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人胰脂肪酶(PL)ELISA试剂盒
标本的采集及保存
1、血清：全血标本请于室温放置2小时或4过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
2、血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于1000 g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
3、其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20或-80保存，但应避免反复冻融。
操作步骤
实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。
1、加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液100，余孔分别加标准品或待测样品100，注意不要有气泡，加样时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板加上盖或覆膜，37温育2小时。为保证实验结果有效
性，每次实验请使用新的标准品溶液。
2、弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液100（临用前配制），酶标板加上覆膜，37温育1小时。
3、弃去孔内液体，甩干，洗板3次，每次浸泡1-2分钟，大约400/每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体拍干）。
4、每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100，加上覆膜，37温育1小时。
5、弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。
6、每孔加底物溶液90，酶标板加上覆膜37避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。
7、每孔加终止溶液50，终止反应，此时蓝色立转黄色。终止液的加入顺序应尽量与底物液的加入顺序相同。
8、立即用酶标仪在450nm波长测量各孔的光密度（OD值）。
应用[4][5]
用于五环三萜类衍生物合成及抑制胰脂肪酶活性研究
首先通过调研大量文献,筛选出具有良好抑酶活性、来源广泛,且易于·结构修饰的熊果酸（Ursolic acid,UA）、齐墩果酸（Oleanolic acid,OA）和山植酸（Maslinicacid,MA）3种三萜类化合物作为研究对象,并对其进行抑酶活性性确认,以及迎过分子模拟选择出C-28位作为结构改造对象。然后,结合Orlistat及抗生素作用特点,在该3种化合物C-28位加入β-内酯或α,β-不饱和酯结构,使其亲电碳原子与PL活性中心的丝氨酸上的羟基氧原子共价结合,以期市可逆抑制转变为不可逆抑制,大大提高抑酶活性,结果活性大大提高,但并未形成共价键。最后,选择抑酶活性最高衍生物进一步进行结构修饰,以期达到形成共价键目的。
主要研究内容与结果如下:1.在前期实验及及量文献调研基础,对筛选出的具有较好抑酶活性的目标化合物UA、OA、MA进行抑酶活性验证。
,进行体外酶活测定实验,得到3种化合物的IC5O值分别为32μg/mL、44μg/mL和54μg/mL;
第二,测定3种化合物抑制类型,结果分别为竞争型抑制、混合型抑制和混合型抑制;
第三,通过分子对接选择C-28位的羧基基团作为改造对象。
2.3种化合物α,β-不饱和酯的合成及活性研究。
,以UA、OA、MA为原料,与溴代α,β-不饱和酯化合,合成了3种三萜类α,β不饱和酯衍生物,通过1H NMR、13CNMR、MS表征,确认三者均为新化合物。
第二,通过体外酶活测定,三种化合物IC5G值分别为9.1μg/mL、10.8μg/mL和25.0μg/mL,其抑酶活性比原化合物分别提高了4.4、5.1、2.7倍,且都为可逆抑制,并未与PL形成共价结合,其抑制类型分别为竞争型抑制、混合型抑制和反竞争型抑制。
3.3种化合物β-内酯衍生物的合成及活性研究。
,以乙烯基乙酸为原料,通过与溴素进行溴代内酯化反应合成了所需的中间体γ-溴代-β内酯化合物,然后再分别与UA、OA、MA化合物反应,合成了3种三萜类-内酯衍生物,通过1HNMR、13CNMR、MS表征,确认三者均为新化合物。
第二,通过体外酶活测定,三种化合物IC5O值分别为7.2μg/mL、31.2μg/mL和70.0μg/mL,其中UA和OA对应衍生物抑酶活性比原化合物分别提高了5.4、1.7倍,MA衍生物的抑制PL活性降低了,且三者都为可逆作用,并未与PL形成共价结合,其抑制类型分别为混合型、竞争型和混合型。
4. 结合第2、3部分实验结果,六种衍生物都未与PL形成共价结合,本部分选择具有最高抑酶活性的UAβ-内酯衍生物进一步进行结构修饰,以期达到与PL形成共价结合的目的。,通过分子对接,发现最高活性衍生物UA-/3-内酯离PL活性中心基团较远。
第二,以UA为原料,对其C-28位羧基进行延长改造,并与前所合成的中间体γ-溴代-β-内酯化合物反应,最终合成了5种三萜类衍生物,并经1HNMR谱确认,且确定最终产物为一新化合物。
第三,通过体外酶活测定,五种化合物IC5（）值分别为36μg/mL、35.2μg/mL、21.3μg/mL、26.4μg/mL、11.2μg/mL,其抑制PL活性比原化合物分别提高了0.1、1.0、2.1、1.5、4.1倍,且都为可逆,并未与PL形成共价结合,其抑制类型分别为竞争型、混合型、混合型、混合型和竞争型。
参考文献
[1]Design,synthesis and in vitro evaluation of novel ursolic acid derivatives as potential anticancer agents[J].Shi-Xian Hua,Ri-Zhen Huang,Man-Yi Ye,Ying-Ming Pan,Gui-Yang Yao,Ye Zhang,Heng-Shan Wang.European Journal of Medicinal Chemistry.2015
[2]Serotonin controlling feeding and satiety[J].J?rg-Peter Voigt,Heidrun Fink.Behavioural Brain Research.2014
[3]Causes of obesity[J].Suzanne Wright,Louis Aronne.Abdominal Imaging.2012(5)
[4]Antihyperlipidemic Components of Cassia auriculata Aerial Parts:Identification Through In Vitro Studies[J].Solomon Habtemariam.Phytother.Res..2012(1)
[5]仝明明.五环三萜类衍生物合成及抑制胰脂肪酶活性研究[D].山西大学,2016.