背景[1-3]
人胃蛋白酶(PEPSIN)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中胃蛋白酶(PEPSIN)的含量。
实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被人胃蛋白酶原（pepsinogen）捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人胃蛋白酶原（pepsinogen）呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人胃蛋白酶(PEPSIN)ELISA试剂盒
样本处理及要求
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
应用[4][5]
用于胃蛋白酶在声带癌中表达的研究
通过免疫组化显色分析胃蛋白酶在声带癌肿瘤组织标本及声带息肉良性病变组织标本中表达强度的不同,探讨咽喉反流与喉癌的相关性。
方法：收集经病理检查确诊为声带鳞状细胞癌的住院患者作为声带癌组,同期收集就诊于该院耳鼻咽喉科并经并病理检查确诊为声带息肉的住院患者作为声带息肉组,招募健康志愿者作为正常对照组。所有人结合自身症状及严重程度填写中文反流症状指数（RSI）量表进行自我评分,行高分辨率食管测压（HREM）,之后再行24小时联合食管多通道腔内阻抗-pH（MII-pH）监测;采集患者及健康组喉部唾液标本,并按统一方法取材,用酶联免疫吸附剂测定方法检测胃蛋白酶浓度;取声带癌组及声带息肉组病变组织作免疫组化监测胃蛋白酶表达水平,并参照Formwitz评分方法确定免疫组化染色组织中胃蛋白酶显色强度。
结果1三组RSI评分比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中声带癌组RSI评分较声带息肉组及对照组高,差异有统计学意义（P均＜0.05）;声带息肉组RSI评分与正常对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。用RSI得分≥13.0作为咽喉反流阳性的诊断指标,其灵敏度为59.5%,特异度为71.4%,Youden指数为0.309。
2高分辨率食管测压（HREM）结果分析,声带癌组食管上括约肌静息压（UESP）较声带息肉组低,差异有统计学意义（P＜0.05）;声带癌组较对照组低,差异亦有统计学意义（P＜0.05）;声带息肉组较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）。三组间食管下括约肌静息压（LESP）、远端收缩积分（DCI）、远端潜伏期（DL）比较差异无统计学意义（P均＞0.05）。
3 24小时多通道腔内阻抗-pH（MII-pH）监测数据分析,三组间咽喉酸反流次数差异有统计学意义（P＜0.05）,声带癌组较声带息肉组及对照组高,差异有统计学意义（P均＜0.05）;声带息肉组与对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。以24小时咽喉酸反流次数≥2作为判定咽喉反流阳性标准,三组间咽喉反流阳性率比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中声带癌组较声带息肉组及对照组高,差异有统计学意义（P均＜0.01）;声带息肉组与对照组比较,差异无统计学意义（P＞0.05）。
4三组间唾液中胃蛋白酶浓度比较,差异有统计学意义（P＜0.05）,其中声带癌组较声带息肉组及对照组高,差异有统计学意义（均为P＜0.05）;声带息肉组较对照组差异无统计学意义（P＞0.05）;以24小时多通道腔内阻抗-pH（MII-pH）监测结果为标准,收集的98例唾液标本中胃蛋白酶浓度做受试者工作特征曲线（ROC曲线）,其分界点（out-off）为23.57 ng/ml,以＞23.57 ng/ml为咽喉反流阳性判定,其灵敏度为88.1%,特异度为85.7%,Youden指数为0.738,ROC曲线下面积（AUC）为0.792（95%CI:0.651~0.934,P=0.002）。
参考文献
[1]Upper esophageal sphincter abnormalities and high-resolution esophageal manometry findings in patients with laryngopharyngeal reflux[J].Tanmayee Benjamin,Shamiq Zackria,Rocio Lopez,Joel Richter,Prashanthi N.Thota.Scandinavian Journal of Gastroenterology.2017(8)
[2]Quality of life,patient satisfaction,and disease burden in patients with gastroesophageal reflux disease with or without laryngopharyngeal reflux symptoms[J].Eun Jeong Gong,Kee Don Choi,Hye‐Kyung Jung,Young Hoon Youn,Byung‐Hoon Min,Kyung Ho Song,Kyu Chan Huh.Journal of Gastroenterology and Hepatology.2017(7)
[3]Optimal timing of saliva collection to detect pepsin in patients with laryngopharyngeal reflux[J].Se Young Na MD,Oh Eun Kwon MD,Young Chan Lee MD,PhD,Young‐Gyu Eun MD,PhD.The Laryngoscope.2016(12)
[4]Prevalence of gastroesophageal reflux disease in M oscow[J].S.Bor,L.B Lazebnik,G.Kitapcioglu,I.Manannikof,Y.Vasiliev.Dis Esophagus.2016(2)
[5]张卫朋.胃蛋白酶在声带癌中表达的研究[D].华北理工大学,2020.