背景[1-3]
人抑肽酶(AP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人抑肽酶(AP)的含量。
人抑肽酶(AP)elisa试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验(elisa)。往预先包被人抑肽酶(AP)捕获抗体的包被微孔中,依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体,经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色,TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抑肽酶(AP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人抑肽酶(AP)ELISA试剂盒
人抑肽酶(AP)elisa试剂盒标本要求
1.血清:室温血液自然凝固10-20分钟,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如出现沉淀,应再次离心。
2.血浆:应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合10-20分钟后,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应该再次离心。
3.尿液:用无菌管收集,离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清,保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清:检测分泌性的成份时,用无菌管收集。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。检测细胞内的成份时,用PBS(PH7.2-7.4)稀释细胞悬液,细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融,以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成,应再次离心。
5.组织标本:切割标本后,称取重量。加入一定量的PBS,PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS(PH7.4),用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右(2000-3000转/分)。仔细收集上清。分装后一份待检测,其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取,提取按相关文献进行,提取后应尽快进行实验。若不能人上进行试验,可将标本放于-20℃保存,但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品,因NaN3抑制辣根过氧化物酶的(HRP)活性。
操作步骤:
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条,剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔,标准品孔各加不同浓度的标准品50μL;
3.样本孔中加入待测样本50μL;空白孔不加。
4.除空白孔外,标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶(HRP)标记的检测抗体100μL,用封板膜封住反应孔,37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体,吸水纸上拍干,每孔加满洗涤液(350μL),静置1min,甩去洗涤液,吸水纸上拍干,如此重复洗板5次(也可用洗板机洗板)。
6.每孔加入底物A、B各50μL,37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL,15min内,在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于CPB加用抑肽酶时ACT、BPT测定与肝素浓度变化的比较观察研究
测定体外循环中肝素化前、肝素化后5分钟及体外循环转机30分钟后血浆肝素浓度、硅藻土激活的全血凝固时间(C-ACT)、高岭土激活的全血凝固时间(K-ACT)及全血凝血酶原时间(BPT),比较在相应肝素浓度下抑肽酶对后三者测定的影响。
材料与方法:随机抽取心脏手术病人血液标本24人共72份,其中术中应用抑肽酶病人12例(实验组),未使用抑肽酶者12例(对照组)。抑肽酶按5万KIU/kg一次性加入预充液。通过人工测定标本BPT、C-ACT,ACT机测定K-ACT,高效毛细管电泳法测定肝素浓度,SPSS11.5软件综合分析各测定值之间的关系。
结果:1.肝素浓度测定实验组和对照组肝素化后5分钟血浆中肝素浓度分别为:5.6±0.5U/ml,5.5±0.3U/ml,p=0.655;体外循环转机30分钟后血浆中肝素浓度为:3.1±0.3U/ml 3.2±0.4 U/ml,p=0.783。两组数据在肝素浓度上无显著差别,可以排除由于肝素浓度存在差别造成的对C-ACT,K-ACT及BPT测定的影响。
2.C-ACT测定实验组和对照组肝素化前ACT硅分别为:111.6±10.8秒,114.8±11.2秒,p=0.572;肝素化后5分钟分别为:549.0±41.1秒542.4±38.9秒,p=0.691;体外循环转机后30分钟分别为:1041.2±265.3秒,717.8±148.0秒,p=0.002。体外循环转机30分钟后实验组和对照组相比存在显著差异,表示抑肽酶对C-ACT测定影响较大。
3.K-ACT测定实验组和对照组肝素化前ACT高分别为:110.3±10.8秒,114.1±12.0秒,p=0.431;肝素化后5分钟分别为:673.3±153.3秒667.8±108.8秒,p=0.921;体外循环转机30分钟后分别为:1206.8±202.6秒,823.9±228.3秒,p=0.000。实验组和对照组在体外循环转机30分钟后数据存在显著差异,抑肽酶对K-ACT测定同样存在较大影响。
4.BPT测定实验组和对照组肝素化前BPT分别为:14.7±1.1秒,14.5±0.9秒,p=0.580;肝素化后5分钟分别为:45.2±7.7秒,43.8±8.5秒,p=0.672;体外循环转机30分钟后分别为:43.7±6.7秒,42.4±4.2秒,p=0.575。各数据间无存在显著差异者,说明BPT测定不受抑肽酶影响。
结论:体外循环下BPT的测定不受抑肽酶影响,在抑肽酶存在情况下仍能较真实反映体外循环中凝血状态,建议以BPT代替ACT作为体外循环中监测抗凝效果的指标。
参考文献
[1]Factor XIa Induced Activation of the Intrinsic Cascade In Vivo[J].Thrombosis and Haemostasis.1996(03)
[2]Aprotinin Prolongs Whole Blood Activated Partial Thromboplastin Time but Not Whole Blood Prothrombin Time in Patients Undergoing Cardiac Surgery[J].George J.Despotis,Alexander Alsoufiev,Lawrence T.Goodnough,Demetrios G.Lappas.Anesthesia&Analgesia.1995(5)
[3]Circulating adhesion molecules in cardiac operations:Influence of high-dose aprotinin[J].Joachim Boldt,Christoph Osmer,Ehrenfried Schindler,Lars-Christoph Linke,Wolfgang-Amadeus Stertmann,Gunter Hempelmann.The Annals of Thoracic Surgery.1995(1)
[4]Effects ofaprotinin on need for blood transfusion after repeat openheart surgery.Royston D,Bidstrup BP,TayLor KM.et al.Lancet,The.1987
[5]董彦博.CPB加用抑肽酶时ACT、BPT测定与肝素浓度变化的比较观察[D].中南大学,2007.