背景[1-3]
人抑肽酶(AP)ELISA试剂盒用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中人抑肽酶(AP)的含量。
人抑肽酶(AP)elisa试剂盒是采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（elisa）。往预先包被人抑肽酶(AP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的人抑肽酶(AP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人抑肽酶(AP)ELISA试剂盒
人抑肽酶(AP)elisa试剂盒标本要求
1.血清：室温血液自然凝固10-20分钟，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如出现沉淀，应再次离心。
2.血浆：应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂，混合10-20分钟后，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应该再次离心。
3.尿液：用无菌管收集，离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。胸腹水、脑脊液参照实行。
4.细胞培养上清：检测分泌性的成份时，用无菌管收集。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。检测细胞内的成份时，用PBS（PH7.2-7.4）稀释细胞悬液，细胞浓度达到100万/ml左右。通过反复冻融，以使细胞破坏并放出细胞内成份。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。
5.组织标本：切割标本后，称取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷冻保存备用。标本融化后仍然保持2-8℃的温度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或匀浆器将标本匀浆充分。离心20分钟左右（2000-3000转/分）。仔细收集上清。分装后一份待检测，其余冷冻备用。
6.标本采集后尽早进行提取，提取按相关文献进行，提取后应尽快进行实验。若不能人上进行试验，可将标本放于-20℃保存，但应避免反复冻融.
7.不能检测含NaN3的样品，因NaN3抑制辣根过氧化物酶的（HRP）活性。
操作步骤：
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
应用[4][5]
用于CPB加用抑肽酶时ACT、BPT测定与肝素浓度变化的比较观察研究
测定体外循环中肝素化前、肝素化后5分钟及体外循环转机30分钟后血浆肝素浓度、硅藻土激活的全血凝固时间（C-ACT）、高岭土激活的全血凝固时间（K-ACT）及全血凝血酶原时间（BPT），比较在相应肝素浓度下抑肽酶对后三者测定的影响。
材料与方法：随机抽取心脏手术病人血液标本24人共72份，其中术中应用抑肽酶病人12例（实验组），未使用抑肽酶者12例（对照组）。抑肽酶按5万KIU／kg一次性加入预充液。通过人工测定标本BPT、C-ACT，ACT机测定K-ACT，高效毛细管电泳法测定肝素浓度，SPSS11.5软件综合分析各测定值之间的关系。
结果：1．肝素浓度测定实验组和对照组肝素化后5分钟血浆中肝素浓度分别为：5.6±0.5U／ml，5.5±0.3U／ml，p=0.655；体外循环转机30分钟后血浆中肝素浓度为：3.1±0.3U／ml 3.2±0.4 U／ml，p=0.783。两组数据在肝素浓度上无显著差别，可以排除由于肝素浓度存在差别造成的对C-ACT，K-ACT及BPT测定的影响。
2．C-ACT测定实验组和对照组肝素化前ACT硅分别为：111.6±10.8秒，114.8±11.2秒，p=0.572；肝素化后5分钟分别为：549.0±41.1秒542.4±38.9秒，p=0.691；体外循环转机后30分钟分别为：1041.2±265.3秒，717.8±148.0秒，p=0.002。体外循环转机30分钟后实验组和对照组相比存在显著差异，表示抑肽酶对C-ACT测定影响较大。
3．K-ACT测定实验组和对照组肝素化前ACT高分别为：110.3±10.8秒，114.1±12.0秒，p=0.431；肝素化后5分钟分别为：673.3±153.3秒667.8±108.8秒，p=0.921；体外循环转机30分钟后分别为：1206.8±202.6秒，823.9±228.3秒，p=0.000。实验组和对照组在体外循环转机30分钟后数据存在显著差异，抑肽酶对K-ACT测定同样存在较大影响。
4．BPT测定实验组和对照组肝素化前BPT分别为：14.7±1.1秒，14.5±0.9秒，p=0.580；肝素化后5分钟分别为：45.2±7.7秒，43.8±8.5秒，p=0.672；体外循环转机30分钟后分别为：43.7±6.7秒，42.4±4.2秒，p=0.575。各数据间无存在显著差异者，说明BPT测定不受抑肽酶影响。
结论：体外循环下BPT的测定不受抑肽酶影响，在抑肽酶存在情况下仍能较真实反映体外循环中凝血状态，建议以BPT代替ACT作为体外循环中监测抗凝效果的指标。
参考文献
[1]Factor XIa Induced Activation of the Intrinsic Cascade In Vivo[J].Thrombosis and Haemostasis.1996(03)
[2]Aprotinin Prolongs Whole Blood Activated Partial Thromboplastin Time but Not Whole Blood Prothrombin Time in Patients Undergoing Cardiac Surgery[J].George J.Despotis,Alexander Alsoufiev,Lawrence T.Goodnough,Demetrios G.Lappas.Anesthesia＆Analgesia.1995(5)
[3]Circulating adhesion molecules in cardiac operations:Influence of high-dose aprotinin[J].Joachim Boldt,Christoph Osmer,Ehrenfried Schindler,Lars-Christoph Linke,Wolfgang-Amadeus Stertmann,Gunter Hempelmann.The Annals of Thoracic Surgery.1995(1)
[4]Effects ofaprotinin on need for blood transfusion after repeat openheart surgery.Royston D,Bidstrup BP,TayLor KM.et al.Lancet,The.1987
[5]董彦博.CPB加用抑肽酶时ACT、BPT测定与肝素浓度变化的比较观察[D].中南大学,2007.