背景[1-3]
人硫酸软骨素(CS)ELISA试剂盒用于测定大鼠血清、血浆及相关液体样本中硫酸软骨素(CS)活性及含量。
实验原理：用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗该指标抗体的微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的抗该指标抗体、HRP标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物TMB显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色,并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的该指标呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度(OD值),计算样品浓度。
人硫酸软骨素(CS)ELISA试剂盒
样品收集、处理及保存
1、细胞培养上清:
适用于检测体外培养的细胞分泌性成份。用无菌管收集细胞上清液,以1000×g离心15分钟,收集上清。
2、细胞:
用PBS反复洗涤细胞3次,调整细胞浓度达到104-106/ml左右,通过反复冻融,使细胞破坏并放出细胞内成份,或者细胞超声粉碎,离心取上清液检测。
3、血清:
在室温下,血液自然凝固,以1000×g离心15分钟,取上清待测。
4、血浆:
应根据标本的要求选择EDTA或柠檬酸钠作为抗凝剂,混合后静置10-20分钟后,以1000×g离心15分钟,收集上清。
操作步骤
1、取出试剂盒,室温(20-25℃)放置30分钟。
2、分组:取出96孔板,根据待测样品数量加上标准品的数量决定所需的板条数,把剩余的板条继续冷藏处理。10个标准孔,1个空白对照
3、标准品的稀释:准备小试管6只,依次编好号码,先在各小试管中加入标准品稀释液100ul,然后取原浓度标准品100ul加入一只已编好号的试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第二支试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第三只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第四只试管中,充分混匀;再在该试管中取100ul加入第五只试管中,充分混匀;然后在该试管中取100ul,弃掉。第六只试管作为0号标准品。
4、加样:依照标准品的顺序分别加入50ul的标准品溶液于空白微孔中;空白对照孔加入50ul的蒸馏水;其余微孔中先加样品40ul然后再加生物素标记的抗体10ul。加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀。
5、温育:用封板膜封板后置37℃温育30分钟。
6、洗涤:小心揭掉封板膜,弃去液体,甩干,每孔加满洗涤液,静置30秒弃去,如此重复5次,拍干。
7、加酶标溶液:标准品组、待测样本组各孔中加入50ul的酶标溶液(空白对照孔除外)。
8、温育:酶标板用封板纸密封后,放入湿盒内于37℃恒温孵育1小时。
9、洗板:用稀释后的洗涤液注满每孔,静置15-30s,充分清洗酶标板5次,用吸水纸彻底拍干。
10、显色:各孔加入显色剂A液50ul后,再加入显色剂B液50ul。
11、终止:25-37℃下避光反应10-15分钟,加入50ul终止液。
12、读板:在450nm波长读取各孔的OD值。
注:读板时必须拭干板底残留的液体和手指痕迹,读板时间控制在终止反应后的30分钟内,以免影响准确性。
数据计算：
以标准物的浓度为横坐标,OD值为纵坐标,在坐标纸上绘出标准曲线,根据样品的OD值由标准曲线查出相应的浓度;或用标准物的浓度与OD值计算出标准曲线的直线回归方程式,将样品的OD值代入方程式,计算出样品浓度,即为样品的实际浓度。
应用[4][5]
用于低分子量硫酸软骨素改善5XFAD小鼠认知功能与机制及其分子量与活性的关系研究
探究CS寡糖的分子量与其抗AD活性和机制之间的关系,从而为LMWCS在抗AD药物应用上的研究提供指导。具体研究内容如下。
（1）LMWCS对5XFAD转基因小鼠认知功能损伤的作用与机制研究采用前期研究中使用的LMWCS对2月龄的5XFAD转基因小鼠进行灌胃给药,设定低、中、高3个剂量组,分别为50mg/kg、150mg/kg和450mg/kg,连续给药3个月。采用Morris水迷宫（Morris water maze,MWM）试验和旷场试验（open field test,OFT）评价小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力等行为学相关的指标。
随后取小鼠的大脑,分离出海马和皮质,并提取各组织的蛋白。采用ELISA（enzyme linked immunosorbent assay）法测定小鼠海马中Aβ1-42含量,并采用蛋白免疫印迹法（Western blot）测定小鼠海马和皮质中的APP及与APP酶切相关的酶PS 1（presenilin l）、BACE1（β-site APP cleaving enzyme 1）和ADAM10（adisintegrin and metalloproteinase family 10）的表达。
采用ELISA法测定小鼠海马中IL-1β（interleukin-1β）、TNF-α（tumornecrosisfactorα）和IL-6含量,并采用Western blot测定小鼠海马和皮质中与炎症相关的GFAP（glial fibrillary acidic protein）、TLR2（toll-like receptor 2）和pERK 1/2（phospho-extracellular regulated protein kinases 1/2）的表达。利用生色底物法测定具有还原性的谷胱甘肽（glutathione,GSH）的含量;利用生色底物法测定GSH-Px（glutathione peroxidase）的活性;利用MDA（malondialdehyde）和TBA（thiobarbituric acid）的显色反应测定小鼠海马中MDA含量;利用氮蓝四唑显色法测定总SOD（superoxidedismutase）活性;,并用Western blott检测小鼠海马和皮质中SOD2的表达。采用Western blot检测phospho-tau（Ser404）的表达,以及与Tau蛋白磷酸化有关的酶phospho-GSK3β（phospho-glycogen synthase kinase 3β）、CDK5（cyclin-dependent kinase 5）、p35和p25的表达。
结果表明,在MWM试验中,服用LMWCS的5XFAD小鼠,潜伏期有一定程度的缩短,穿过平台和目标象限的次数有一定的增加,在目标象限的路程和时间也有一定的延长;而在OFT中,LMWCS对5XFAD小鼠穿过中心区域的路程和总路程均有一定的提高。总的来说,LMWCS对5XFAD小鼠的兴奋性、活跃度、空间学习和记忆能力均有一定的改善。
参考文献
[1]Deterioration,Compensation and Motor Control Processes in Healthy Aging,Mild Cognitive Impairment and Alzheimer’s Disease[J].Poirier Gabriel,Ohayon Alice,Juranville Adrien,Mourey France,Gaveau Jeremie.Geriatrics.2021(1)
[2]Protective effects of chondroitin sulphate nano-selenium on a mouse model of Alzheimer’s disease[J].Dongsheng Ji,Xiaming Wu,Delong Li,Ping Liu,Sitao Zhang,Debo Gao,Fei Gao,Mengxiao Zhang,Yuliang Xiao.International Journal of Biological Macromolecules.2020(C)
[3]MRI and cognitive scores complement each other to accurately predict Alzheimer’s dementia 2 to 7 years before clinical onset[J].Azar Zandifar,Vladimir S.Fonov,Simon Ducharme,Sylvie Belleville,D.Louis Collins.NeuroImage:Clinical.2020(C)
[4]Chondroitin sulfate derived theranostic and therapeutic nanocarriers for tumor-targeted drug delivery[J].Abdur Rauf Khan,Xiaoye Yang,Xiyou Du,Haotong Yang,Yuanxiu Liu,Abdul Qayyum Khan,Guangxi Zhai.Carbohydrate Polymers.2020(C)
[5]赵娜.低分子量硫酸软骨素改善5XFAD小鼠认知功能与机制及其分子量与活性的关系研究[D].山东大学,2021.