背景[1-3]
人结直肠腺癌细胞CACO-2分离自一位72岁男性直肠原位癌，人结肠癌Caco-2细胞系在标准培养条件下汇合后，自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型。
Caco-2细胞分离自直肠原位癌；当长到满时，Caco-2细胞表现出特征性的肠上皮细胞分化。Caco-2细胞表达维甲酸结合蛋白I和维甲酸结合蛋白Ⅱ，并呈角质蛋白阳性。
人结直肠腺癌细胞CACO-2
人结直肠腺癌细胞（CaCo-2）一般呈岛状生长，Caco-2细胞群中常常含有巨大的空泡，这是CaCo-2细胞本身的特性，属于正常现象。
Caco-2传代周期较长，倍增时间约为72h。这是因为Caco-2贴壁和生长都较为缓慢。按1:4传代的情况下，约一周传代一次。
Caco-2细胞较难消化，细胞间连接紧密，使得细胞难以解离。通常加入胰酶后，细胞克隆的四周先飘起来，中间仍贴壁；随后整片克隆脱落，但细胞与细胞间不会分散。消化时间为5-10分钟，该细胞难以被吹散为单个细胞，当细胞能够被吹散为小的细胞团块，即可终止消化。
Caco-2贴壁缓慢，在标准培养条件【EMEM＋20%FBS＋1%P/S】下，接种后需要48小时以上完成贴壁。推荐接种后第三天再换液。期间不要频繁观察或晃动培养皿。
Caco-2有少量发亮的细胞漂浮或黏附在细胞克隆上，是正常的，随后会进入克隆并正常生长。所以避免频繁观察细胞，可以减少漂浮细胞产生。如果细胞随着培养过程，漂浮得越来越严重，甚至大块儿飘起，就要检查培养基成分、培养环境是否出现异常。细胞密度越高，消化时间越长。
应用[4][5]
用于肠时钟基因Bmal1调控代谢酶CES1节律表达和活性的研究
考察肠道CES1的节律表达和活性,并探究肠时钟因子BMAL1对其表达及活性的节律调控作用。
方法:1.采用PCR扩增和电泳技术对Bmal1肠特异性敲除鼠(Bma11i KO)的基因型进行鉴定。于6个不同昼夜时点（ZT2、ZT6、ZT10、ZT14、ZT18和ZT22）,采用实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（RT-q PCR）和蛋白免疫印迹（Western blotting）技术分别检测Bma11i KO和对照鼠(Bmal1fl/fl)小肠中Ces各亚型m RNA和CES蛋白的表达,筛查出节律性表达的CES酶。
2. 基于体外细胞（小鼠结肠癌细胞CT26和人结直肠腺癌细胞Caco-2）模型,通过血清刺激实验考察Ces1d/CES1的表达是否具有节律。此外,采用si RNA进行Bmal1/BMAL1敲低实验,考察Bmal1/BMAL1敲低对Ces1d/CES1节律表达的影响。
3. 基于Bmal1i KO和对照鼠,采用超高速离心法提取不同时间点（ZT6和ZT18）的小鼠肠微粒体。以CES1特异性底物霉酚酸酯（MMF）为模型药,采用肠微粒体进行体外酶孵育实验,评价不同时间点肠微粒体中CES1酶的活性。此外,基于Bmal1i KO和对照鼠进行MMF的药代动力学研究。于不同昼夜时点（ZT6和ZT18）灌胃给予小鼠MMF（50 mg/kg）,并在设定时间点收集血浆和组织样品。采用超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS/MS）法测定血浆及组织中的药物浓度。
4. 基于CT26和Caco-2细胞模型,采用Bmal1/BMAL1高表达和敲低技术,验证Bmal1/BMAL1对CES1的调控效应。
5. 采用JASPAR数据库预测Ces1d/CES1启动子上潜在的E-box结合位点。采用双荧光素酶报告基因和染色质免疫沉淀（Ch IP）实验解析BMAL1调控Ces1d/CES1表达的机制。
结果:1.肠CES1表达具有节律性。qPCR结果显示,4种Ces1亚型（Ces1d、Ces1e、Ces1f和Ces1g）和7种Ces2亚型（Ces2a、Ces2b、Ces2c、Ces2e、Ces2f、Ces2g和Ces2h）在对照鼠小肠中均有表达。进一步分析发现,Ces1d m RNA的表达具有昼夜节律性,而其它Ces亚型的m RNA表达无节律变化。此外,CES1总蛋白的表达也具有节律性,其在ZT6的表达最高。肠Bmal1敲除后,CES1总蛋白的表达降低,且节律消失。
2. 细胞内Ces1d/CES1的节律性表达。实验结果显示,血清刺激可诱导CT26细胞中Ces1d的节律性表达。肠Bmal1敲低后,Ces1d的表达降低,且节律消失。同时,血清刺激亦可诱导Caco-2细胞中CES1的节律表达,而BMAL1敲低后,CES1的表达降低,且节律消失。
3.BMAL1节律性调控肠CES1酶活性。体外酶孵育结果显示,对照鼠肠微粒体中CES1酶活性具有时辰差异,其在ZT6的活性高于ZT18的活性。而肠Bmal1缺失后,CES1酶活性明显降低,且节律消失。体内药动学结果显示,对照鼠的药动学行为具有时辰差异:ZT6给药与ZT18给药相比,代谢产物霉酚酸（MPA）具有更高的血浆暴露水平。而肠Bmal1敲除后,MPA的暴露量显著降低,且时辰差异消失。
参考文献
[1]The Circadian Clock Gene Bmal1 Controls Intestinal Exporter MRP2 and Drug Disposition[J].Theranostics.2019(10)
[2]Circadian sensitivity to the cardiac glycoside oleandrin is associated with diurnal intestinal P-glycoprotein expression[J].Cui Zhou,Fangjun Yu,Peng Zeng,Tianpeng Zhang,Hao Huang,Wenying Chen,Baojian Wu.Biochemical Pharmacology.2019(C)
[3]The intestinal microbiota programs diurnal rhythms in host metabolism through histone deacetylase 3[J].Zheng Kuang,Yuhao Wang,Yun Li,Cunqi Ye,Kelly A.Ruhn,Cassie L.Behrendt,Eric N.Olson,Lora V.Hooper.Science.2019(6460)
[4]The transcription factor E4bp4 regulates the expression and activity of Cyp3a11 in mice[J].Yongbin Tong,Peng Zeng,Tianpeng Zhang,Mengjing Zhao,Pei Yu,Baojian Wu.Biochemical Pharmacology.2019
[5]陈洵.肠时钟基因Bmal1调控代谢酶CES1节律表达和活性的研究[D].暨南大学,2021.