背景[1-3]
人纤维母细胞表面抗原(FSP)ELISA KIT用于体外定量检测血清、血浆、组织匀浆及相关液体样本中纤维母细胞表面抗原(FSP)的含量。
实验原理:试剂盒采用双抗体一步夹心法酶联免疫吸附试验（ELISA）。往预先包被纤维母细胞表面抗原(FSP)捕获抗体的包被微孔中，依次加入标本、标准品、HRP标记的检测抗体，经过温育并彻底洗涤。用底物TMB显色，TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的纤维母细胞表面抗原(FSP)呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD值），计算样品浓度。
人纤维母细胞表面抗原(FSP)ELISA KIT
样本处理及要求
1.血清：将收集于血清分离管的全血标本在室温放置2小时或4℃过夜，然后1000×g离心20分钟，取上清即可，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
2.血浆：用EDTA或肝素作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2-8℃1000×g离心15分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
3.组织匀浆：用预冷的PBS(0.01M,pH=7.4)冲洗组织，去除残留血液（匀浆中裂解的红细胞会影响测量结果），称重后将组织剪碎。将剪碎的组织与对应体积的PBS（一般按1:9的重量体积比，比如1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂）加入玻璃匀浆器中，于冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎，或反复冻融。最后将匀浆液于5000×g离心5~10分钟，取上清检测。
4.细胞培养物上清或其它生物标本：请1000×g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20℃或-80℃保存，但应避免反复冻融。
操作步骤
1.从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃。
2.设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μL；
3.样本孔中加入待测样本50μL；空白孔不加。
4.除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100μL，用封板膜封住反应孔，37℃水浴锅或恒温箱温育60min。
5.弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液（350μL），静置1min，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次（也可用洗板机洗板）。
6.每孔加入底物A、B各50μL，37℃避光孵育15min。
7.每孔加入终止液50μL，15min内，在450nm波长处测定各孔的OD值。
实验结果计算
以所测标准品的OD值为横坐标，标准品的浓度值为纵坐标，在坐标纸上或用相关软件绘制标准曲线，并得到直线回归方程，将样品的OD值代入方程，计算出样品的浓度。
应用[4][5]
用于CCL21/CCR7信号途径与移植肾纤维化关系的研究
通过免疫组织化学和免疫荧光双重染色的方法,观察CCL21和CCR7在移植肾穿刺活检组织中的表达情况,同时观察纤维母细胞的标记物FSP和S100A4在移植肾穿刺组织中的分布,选择纤维母细胞的标示物,此外,结合临床资料分析肾移植病人临床预后与FSP、CCL21和CCR7表达的关系,初步探索纤维母细胞和CCL21/CCR7信号通路与移植肾纤维化的关系。
方法:收集肾脏穿刺标本78例,常规HE染色、PAS染色和MASSOM染色后进行病理诊断,而后对各阶段移植肾穿刺活检病例进行纤维母细胞表面抗原FSP,纤维母细胞特异抗原S100A4,趋化因子CCL21和其受体CCR7的免疫组织化学染色,观察各抗体的分布及表达;再利用CCL21分别和FSP、CCR7进行免疫荧光双重染色,在共聚焦显微镜下观察定位它们的表达情况,探讨CCL21/CCR7信号通路与移植肾纤维化的关系,并结合临床资料分析纤维母细胞和CCL21/CCR7信号通路与病人的临床发展联系。
结果:FSP、S100A4、CCR7、CCL21均在移植肾活检组织中存在阳性表达。FSP主要表达在纤维母细胞和肾小管,FSP在纤维母细胞的表达,急性排异反应组高于未见明显排异反应和免疫抑制剂肾毒性组（相对正常组）（P＜0.01）,慢性排异反应组高于移植肾交界性病变组（P＜0.05）和相对正常组（P＜0.01）。S100A4主要表达在间质细胞（纤维母细胞、炎细胞）和毛细血管内皮细胞,在间质细胞的表达细胞数服从正态分布,其计量资料表示为54.9±34.2（x±s）。
S100A4在间质细胞的表达,急性排异反应组（P＜0.01）、慢性排异反应组（P＜0.01）、移植肾交界性病变组（P＜0.05）均高于相对正常组的表达,其他组之间的表达差异无统计学意义。FSP和S100A4均可表达于肾小球内。
此外,在炎细胞多的组织区域纤维母细胞的数量有增多趋势,且细胞胞浆较丰富。CCR7主要表达在血管壁,在部分萎缩的肾小管及间质中也可见阳性表达细胞,CCR7在血管的阳性表达细胞数服从正态分布,其计量资料用21.6±13.5（x±s）表示,CCR7在各病变组的阳性表达细胞数没有区别。CCL21主要在肾小管上皮细胞和少量浆细胞和纤维母细胞表达,其在各种病变的阳性表达细胞数没有区别。
免疫荧光双重染色,FSP、CCR7和CCL21在肾小管和间质都有阳性表达细胞,FSP和CCL21共表达于间质细胞和肾小管上皮细胞。CCR7和CCL21也在某些间质细胞和肾小管上皮细胞共表达。
参考文献
[1]Chronic Allograft Nephropathy[J].Nidyanandh Vadivel,Stefan G.Tullius,Anil Chandraker.Seminars in Nephrology.2007(4)
[2]Banff’05 Meeting Report:Differential Diagnosis of Chronic Allograft Injury and Elimination of Chronic Allograft Nephropathy（‘CAN’）[J].K.Solez,R.B.Colvin,L.C.Racusen,B.Sis,P.F.Halloran,P.E.Birk,P.M.Campbell,M.Cascalho,A.B.Collins,A.J.Demetris,C.B.Drachenberg,I.W.Gibson,P.C.Grimm,M.Haas,E.Lerut,H.Liapis,R.B.Mannon,P.B.Marcus,M.Mengel,M.J.Mihatsch,B.J.Nankivell,V.Nickeleit,J.C.Papadimitriou,J.L.Platt,P.Randhawa,I.Roberts,L.Salinas‐Madriga,D.R.Salomon,D.Seron,M.Sheaff,J.J.Weening.American Journal of Transplantation.2007(3)
[3]Investigation of liver fibrosis in clinical practice[J].J.F.Blanc,P.Bioulac-Sage,C.Balabaud,A.Desmoulière.Hepatology Research.2005(1)
[4]The role of epithelial-to-mesenchymal transition in renal fibrosis[J].Michael Zeisberg,Raghu Kalluri.Journal of Molecular Medicine.2004(3)
[5]高婷.CCL21/CCR7信号途径与移植肾纤维化关系的研究[D].吉林大学,2009.