背景[1-3]
NCI-H292（人肺癌细胞(淋巴结转移)）源自肺支气管黏液上皮样癌的淋巴结转移灶；先用成份限定的培养基分离得到，然后换成含血清的培养基培养。培养条件下，NCI-H292细胞保留了黏液上皮的特性，可从其超微结构的表现和多种鳞状上皮分化标记的表达而判断。NCI-H292细胞支持HBV的生长，脱羧酶阴性。NCI-H292细胞可以作为筛选模型，将人类亚基因组片段转染入细胞来研究HBV及其自身基因在病毒性肝炎和肝癌发生中的作用。NCI-H292细胞角蛋白、波形蛋白、黏液洋红染色阳线，但神经丝三联蛋白阴性。
NCI-H292（人肺癌细胞(淋巴结转移)）
NCI-H292（人肺癌细胞(淋巴结转移)）培养步骤
一、复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入5mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心5分钟，弃去上清液，补加4-6mL完全培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入6cm皿中），培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
二、细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1. 弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2. 加1-2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加5ml以上含10%血清的完全培养基终止消化。
3.轻轻吹打细胞，完全脱落后吸出，在1000RPM条件下离心8-10分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4. 按5-6ml/瓶补加培养液，将细胞悬液按1：2的比例分到新的含5-6 ml培养液的新皿中或者瓶中。
b）传代方法：
方法一：收集细胞，1000RPM条件下离心8-10分钟，弃上清液，补加1-2ml培养液后吹匀，将细胞悬液按1:2到1:5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或瓶中。
方法二：可选择半数换液方式，弃半数培养基后，将剩余细胞悬起，将细胞悬液按1:2到1:3的比例分到新的含8ml培养基新皿中或者瓶中。
三、细胞冻存：（注：无血清冻存液冻存细胞的方法请参考我司官网货号：C7001）
1、细胞生长至覆盖培养瓶的80%面积时，弃25cm2培养瓶中的培养液，用PBS清洗细胞一次；
2、添加0.25%胰蛋白酶消化液约1ml至培养瓶中，倒置显微镜下观察，待细胞回缩变圆后加入完全培养液终止消化，轻轻吹打细胞使之脱落，然后将悬液转移至15ml离心管中，1000rpm离心5min；
3、用适量的冻存液重悬细胞，并放置于冻存管中；
4、先将细胞冻存管放置于-20℃ 1.5h，然后将其移入-80℃。
应用[4][5]
NCI-H292（人肺癌细胞(淋巴结转移)）可以用于JNK信号通路在多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞凋亡中的作用及其机制研究
探讨c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)通路在多聚左旋精氨(Poly-L-arginine,PLA)诱导NCI-H292细胞凋亡中的作用及其分子机制。
方法:1、细胞培养:NCI-H292细胞生长于10%胎牛血清+100 mg/L青霉素+100 mg/L链霉素+12mmol/L L-谷氨酰胺的RPMI1640培养液中,于37℃、5%CO2培养箱内培养,每2天换液1次。
2、Western Blot法检测JNK信号通路蛋白的表达选择PLA为凋亡诱导物,诱导气道上皮细胞NCI-H292的凋亡。分别以0 mg/L、10 mg/L、20 mg/L、40 mg/L、60 mg/L浓度的PLA刺激NCI-H292细胞24小时后提取各组细胞总蛋白,采用Western Blot法检测各组细胞内P-JNK/JNK表达有无差异。
3、Annexin V-FITC/PI双染法检测NCI-H292细胞凋亡情况将NCI-H292细胞设为空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组,按照分组要求提前1h用特异性JNK通路抑制剂SP600125预处理NCI-H292细胞,然后加入PLA,处理细胞24小时后收集各组细胞,采用Annexin V和PI双染的方法,染色凋亡的NCI-H292细胞,并于4小时内进行流式细胞的检测分析,观察JNK通路抑制剂SP600125(10μM)作用前后细胞的凋亡情况。
4、Western blot检测凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2、Casepase-3的表达采用Western Blot方法分别检测空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组中NCI-H292细胞内Bax、Bcl-2、Casepase-3的表达和信号通路蛋白JNK、P-JNK的表达。
5、统计学处理采用SPSS17.0统计软件进行分析,结果以均数±标准差表示,多组数据间比较采用单因素方差分析(One-Way ANOVA);两两间比较当方差齐时采用LSD-t检验,方差不齐时采用Dunnett′s T3检验,P<0.05表示差异有统计学意义。
结果:1、PLA浓度10 mg/L组作用NCI-H292细胞后JNK磷酸化水平与0mg/L组比较无统计学差异(P=0.179),PLA作用浓度为20 mg/L组、40 mg/L组、60 mg/L组的JNK磷酸化水平与0mg/L组比较均增加,且呈现剂量依赖性,差异有统计学意义(F=4.239,P均<0.05)。
2、空白对照组、PLA组、SP600125组、PLA+SP600125组NCI-H292细胞凋亡率分别为(5.13±1.12)%、(22.62±1.66)%、(5.69±0.18)%、(8.99±1.74)%,各组间差异有统计学意义(F=113.961,P<0.001);PLA组NCI-H292细胞凋亡率与空白对照组相比明显增高(P<0.001);PLA+SP600125组与PLA组比较细胞凋亡率明显降低(P<0.001)。
3、PLA(40 mg/L)作用于NCI-H292细胞后,P-JNK/JNK比值与空白对照组相比明显升高(F=31.778,P<0.001);凋亡相关蛋白Bcl-2/Bax比值降低(F=21.077,P<0.01);Caspase-3表达明显升高(F=31.768,P<0.001)。
参考文献
[1]E-Cigarette Vapor Induces an Apoptotic Response in Human Gingival Epithelial Cells Through the Caspase-3 Pathway.[J]. Rouabhia Mahmoud;;Park Hyun Jin;;Semlali Abdelhabib;;Zakrzewski Andrew;;Chmielewski Witold;;Chakir Jamila.Journal of cellular physiology,2017(6)
[2] Control of local immunity by airway epithelial cells.[J]. Weitnauer M;;Mijo?ek V;;Dalpke A H.Mucosal immunology,2016(2)
[3] Aeroallergen Der p 2 induces apoptosis of bronchial epithelial BEAS-2B cells via activation of both intrinsic and extrinsic pathway.[J]. Lin Chun-Hsiang;;Hong Yu-Chuan;;Kao Shao-Hsuan.Cell & bioscience,2015(1)
[4] BAX-Induced Apoptosis Can Be Initiated through a Conformational Selection Mechanism[J]. Chia-Jung Tsai;;Sophia Liu;;Chien-Lun Hung;;Siao-Ru Jhong;;Tai-Ching Sung;;Yun-Wei Chiang.Structure,2014
[5]吴莎莎. JNK信号通路在多聚左旋精氨酸诱导NCI-H292细胞凋亡中的作用及其机制研究[D].安徽医科大学,2018.