背景[1-3]
人肝母细胞瘤细胞是上皮细胞样贴壁细胞肝癌细胞，HuH-6细胞可产球蛋白和甲胎蛋白。生长培养基：DMEM＋10%FBS＋1%P/S，培养条件气相：空气95%；CO25%温度：37℃。
人肝母细胞瘤细胞
HuH-6人肝母细胞瘤细胞培养操作：
1）复苏人肝母细胞瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人肝母细胞瘤细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人肝母细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人肝母细胞瘤细胞可以用于KLF5基因在人肝母细胞瘤中的作用及机制研究
通过干扰KLF5在HB肿瘤细胞中的表达,通过体外和体内实验,探索KLF5在HB肿瘤细胞增殖、凋亡等细胞生物学行为中的作用,为肝母细胞瘤的治疗发现新的靶点。
通过RNA干扰技术,构建KLF5基因sh RNA慢病毒载体,转染肝母细胞瘤Huh6及Hep G2细胞,获得KLF5基因稳定沉默的Huh6及Hep G2细胞系,探讨KLF5对Huh6及Hep G2细胞增殖、凋亡及裸鼠体内成瘤能力等的影响及机制。
方法:1、体外培养人肝母细胞瘤Huh6细胞及Hep G2细胞,设计KLF5基因的特异性sh RNA靶点,构建3条不同的sh RNA慢病毒载体并感染Huh6及Hep G2细胞,采用Real-time PCR方法检测Huh6细胞中KLF5的m RNA水平变化,Western Blot方法用以检测KLF5蛋白水平的表达,选择2条干扰效果较好的sh RNA基因,作为后期研究和病毒包装实验基因,构建基因稳定沉默的细胞系。用不含KLF5 sh RNA的质粒慢病毒感染细胞作为阴性对照。
2、采用克隆形成实验、CCK8增殖试验、流式细胞术、Western-Blot及PCR等实验方法检测KLF5基因沉默后Huh6及Hep G2细胞的增殖、凋亡、下游分子等生物学行为的变化及机制。
3、将KLF5基因沉默后Huh6细胞移植到裸鼠皮下,培养6周后取肿瘤组织,测肿瘤直径,对肿瘤组织行KLF5、Ki67免疫组化染色,并与NC组进行对比。
4、收集KLF5实验组及NC组Huh6细胞及Hep G2细胞RNA,送检RNA-Seq,进行下游相关分析。
结果:1、成功构建3条sh RNA-KLF5慢病毒载体,选择2条干扰效果佳的sh RNA,感染Huh6及Hep G2细胞,建立KLF5稳定表达的细胞系。
2、克隆形成实验结果显示,KLF5基因沉默组克隆形成率与对照组相比明显降低(p<0.05);CCK8的增殖实验结果提示当基因KLF5沉默后相关细胞增殖能力明显降低(p<0.05);流式细胞术分析肿瘤细胞凋亡率变化,结果提示基因沉默组肿瘤细胞的凋亡率明显增高(p<0.05)。
3、裸鼠体内成瘤实验显示,KLF5基因沉默组肿瘤直径均明显小于对照组(p<0.05)。干扰组肿瘤KLF5及Ki67的表达阳性率显著低于对照组(p<0.001)。
4、Western-Blot实验显示,与NC组相比,Huh6细胞实验组中,PARP条带可见明显分割,ELF3表达量可见下调,HNF1A、HNF4A、Cyclin D1无明显变化;Hep G2细胞实验中,MAFF表达量可见明显下调。
结果提示肝母细胞瘤细胞的凋亡途径可能与PARP有关,MAFF及ELF3可能是KLF5的下游基因。
结论:1、成功构建3条sh RNA-KLF5慢病毒载体,筛选出2条沉默效率好的KLF5干扰基因sh1及sh3,构建KLF5稳定沉默的肝母细胞瘤Huh6及Hep G2细胞系。
2、KLF5可能通过影响肝母细胞瘤细胞的增殖、凋亡而促进肝母细胞瘤的增殖。
3、KLF5可能通过PARP凋亡途径调控肝母细胞瘤的增殖。
4、MAFF及ELF3可能是KLF5的下游基因。
参考文献
[1]Identification of potential key genes and miRNAs involved in Hepatoblastoma pathogenesis and prognosis[J].Taha Aghajanzadeh;Kiarash Tebbi;Mahmood Talkhabi.Journal of Cell Communication and Signaling,2020(prep)
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[5]韩蕊.KLF5基因在人肝母细胞瘤中的作用及机制研究[D].苏州大学,2021.