背景[1-3]
人非小细胞肺癌细胞建于1994年三月。这株肺腺癌在EGFR酪氨酸激酶区域有一个获得性突变(E746-A750缺失)。患者在25岁到26岁时每个月抽1包烟。在诊断前12年不再抽烟。
人非小细胞肺癌细胞
人非小细胞肺癌细胞培养步骤：
一．人非小细胞肺癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号21875-091)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）人非小细胞肺癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人非小细胞肺癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．人非小细胞肺癌细胞处理：
1）复苏人非小细胞肺癌细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人非小细胞肺癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将人非小细胞肺癌细胞悬液按1：4的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人非小细胞肺癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1，人非小细胞肺癌细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
人非小细胞肺癌细胞可以用于白屈菜红碱脂质体的制备及其对非小细胞肺癌HCC827的抑制作用研究
研究CHE体外抗肿瘤药效与机制,构建、表征CHE脂质体并评价其体内药效及药动学行为,探索CHE脂质体减毒及增效作用,为CHE的应用开发提供参考。
方法:1.CHE体外抗肿瘤作用研究:采用MTT法、FITC-Annexin V双染法、PI单染法、荧光探针DCFH-DA、JC-1试剂盒、caspase3活性检测试剂盒、western blot实验,分别评价CHE对非小细胞肺癌细胞系HCC827细胞的细胞毒性、凋亡、周期、活性氧(ROS)、线粒体膜电位、caspase3活性、蛋白PKC-ε的影响。
2.CHE处方前研究:建立HPLC含量测定方法并进行方法学考察;测定CHE的平衡溶解度、表观油水分配系数,评价CHE基本理化性质。
3.白屈菜红碱脂质体(CHELP)处方单因素考察:以载药量为评价指标,通过单因素实验分别考察了脂质材料比例、药脂比、药物孵育p H及孵育时间对CHELP处方的影响。
4.CHELP处方优化:以CHOL:HSPC(w/w)、药脂比、药物孵育时间作为考察因素,以粒径和载药量作为考察指标,以星点设计优化CHELP处方。
5.CHELP的表征:观察形态,测定粒径、Zeta电位、包封率及载药量;在4°C评价脂质体的稳定性;采用透析法对CHELP进行体外释放研究。
6.CHELP药动学初步评价:建立CHE小鼠血浆LC-MS/MS测定方法并进行方法学考察;CHE、CHELP分别按6 mg/kg剂量尾静脉注射给药,定时取点采血进行药动学初步研究。
7.CHELP体内抑制肿瘤作用:HCC827非小细胞肺癌肿瘤模型造模后,CHE、CHELP分别按10 mg/kg剂量尾静脉注射给药。以肿瘤体积、肿瘤质量、抑瘤率、tunel染色、ROS检测、蛋白PKC-ε表达量等为指标初步评价抑瘤作用。通过小鼠体重、脏器系数及HE染色初步评价脂质体制剂的安全性。
结果:1.CHE体外细胞实验研究:CHE对非小细胞肺癌细胞系HCC827细胞的半抑制浓度IC50值为15.13±0.93μM;通过介导ROS/PKC-ε/Caspase 3通路诱导HCC827细胞凋亡,细胞周期阻滞在G2/M期,促进ROS增加,降低线粒体膜电位,上调caspase 3活性并抑制蛋白PKC-ε表达。
2. CHE处方前研究:CHE的HPLC含量测定方法可行;CHE水溶性好,在水中时Log P值最小为-1.53。
3. CHELP处方单因素考察:在辅料CHOL:DSPE-PEG2000:HSPC的比例为1:1:3(w/w),药脂比为1:4,药物孵育p H值为8.0,药物孵育时间为30 min时,脂质体的载药量最高。
4. CHELP处方优化:经星点设计效应面法优化,脂质体的粒径、载药量的回归方程拟合良好,预测工艺因素为CHOL:HSPC为0.87:1(w/w),药脂比0.21,孵育时间26.54 min。
5.CHELP表征:外观澄清均一,平均粒径为126.1±1.9nm,PDI小于0.3;Zeta电位为-40.1±2.2 m V;包封率为83.94±1.72%;载药量为16.67±0.32%;4℃条件下稳定;体外累积释放率小于20%,与CHE相比具有缓释效果。
6.药代动力学评价:与CHE相比,CHELP药时曲线下面积AUC0-t为4.349mg/L·h,较CHE增加近15倍;最高血药浓度Cmax增大为19.122 mg/L;清除率CL降低为1.353 L/h/kg;表观分布容积V降低为12.832 L/kg。
7.CHELP体内抗肿瘤作用初步评价:CHE和CHELP均有抑瘤作用,其中CHELP治疗组中肿瘤体积与质量个体差异更小,治疗作用均一。在给药干预期间,CHE治疗组内3只动物死亡,其余裸鼠也表现出明显机体损伤,但CHELP治疗组未发生上述情况,脂质体具有提高药物安全性的作用。
结论:CHE可能通过介导ROS/PKC-ε/Caspase 3通路诱导非小细胞肺癌细胞系HCC827细胞凋亡,抑制肿瘤细胞生长,体内试验也证明了其抑瘤效果。CHE脂质体制剂具有缓释作用,并在一定程度上能够减轻CHE的毒性反应。
参考文献
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[4]Efficacy and long-term survival of advanced lung adenocarcinoma patients with uncommon EGFR mutations treated with 1st generation EGFR-TKIs compared with chemotherapy as first-line therapy[J].Haixia Li;;Chenyu Wang;;Ziqi Wang;;Yabo Hu;;Guowei Zhang;;Mina Zhang;;Xuanxuan Zheng;;Xiaojuan Zhang;;Jinbo Yang;;Zhiyong Ma;;Huijuan Wang.Lung Cancer,2019
[5]王佳慧.白屈菜红碱脂质体的制备及其对非小细胞肺癌HCC827的抑制作用研究[D].上海中医药大学,2020.