背景[1-3]
人原位胰腺腺癌细胞是一种人类胰腺腺癌细胞系，是由一名50岁的男性患者的原位胰腺腺癌组织分离得到的。该细胞系于1975年由美国国立癌症研究所（NCI）的J. Fogh等人建立。
人原位胰腺腺癌细胞
人原位胰腺腺癌细胞系的培养方法步骤：
1. 人原位胰腺腺癌细胞培养基配制
人原位胰腺腺癌细胞的培养基需要配制和准备好。常用的培养基包括DMEM（Dulbecco's Modified Eagle's Medium）和RPMI（Roswell Park Memorial Institute）1640培养基。在培养基中加入10%的胎牛血清（FBS）和1%的青霉素/链霉素（penicillin/streptomycin）混合抗生素，混合均匀后可以用于培养人原位胰腺腺癌细胞。
2. 人原位胰腺腺癌细胞的解冻
人原位胰腺腺癌细胞可以从冷冻存储的细胞库中解冻。将冻存管放在37℃的水浴中，快速将管子中的细胞解冻。添加预先配置好的培养基到细胞中，轻轻混合细胞和培养基，将混合物转移至预先消毒的离心管中。将细胞离心10分钟，去除上清液，再次加入预先配置好的培养基，将细胞转移至预先消毒的培养皿中。
3. 人原位胰腺腺癌细胞的培养
将培养皿放置在37℃的恒温培养箱中，保持5%的CO2气氛和适当的湿度。每隔1-2天更换一次新的培养基，以促进细胞的生长和增殖。注意不要在细胞培养期间将细胞暴露在空气中，以防细胞受到氧化损伤。
4. 人原位胰腺腺癌细胞的传代
当细胞密度达到80-90%时，需要进行细胞的传代。将培养皿中的细胞用1X PBS洗涤一次，加入0.25%的胰蛋白酶（trypsin）溶液，将细胞在37℃的恒温箱中消化5-10分钟，将胰蛋白酶溶液去除，加入新的培养基，轻轻混合细胞和培养基，将混合物转移至新的培养皿中。注意在传代时不要过度消化细胞，以免影响细胞的生长和增殖。
5. 人原位胰腺腺癌细胞的冻存
在细胞的生长和增殖期间，需要定期将细胞进行冻存。将人原位胰腺腺癌细胞中的培养基去除，加入10%的DMSO（dimethyl sulfoxide）和90%的FBS混合液，缓慢混合细胞和混合液，将混合物转移至预先消毒的冻存管中。将冻存管放置在-80℃的冰箱中，长期保存。
应用[4][5]
人原位胰腺腺癌细胞可以用于Toll样受体7激活对胰腺癌细胞株（BxPC-3）增殖、迁移与凋亡的影响及机制研究
tlr7的激活对胰腺癌细胞株(bxpc-3)增殖、迁移与凋亡的影响及其机制研究。
方法:培养人原位胰腺腺癌bxpc-3细胞,通过实时荧光定量(real-time)pcr和westernblot分析,检测tlr7受体在mrna和蛋白水平上的表达。以不同剂量(0μg/ml、1.5μg/ml、3.0μg/ml、5.0μg/ml)的tlr7配体gardiquimod经不同的时间(1d、2d、3d、4d、5d)体外刺激bxpc-3细胞,mts及流式细胞术分析tlr7的激活对bxpc-3细胞增殖的影响。tlr7配体gardiquimod(3μg/ml)处理bxpc-3细胞(1-6d),划痕实验方法分析,检测其对bxpc-3细胞的迁移影响。
tlr7配体gardiquimod(3μg/ml)经不同的时间(1-5d),体外刺激bxpc-3细胞,流式细胞术分析其对bxpc-3细胞的凋亡影响。培养bxpc-3细胞,tlr7配体gardiquimod(3μg/ml)经不同的时间(0min、12min、30min、1h、3h、6h、12h、24h、48h),体外刺激bxpc-3细胞,作用12h后,通过westernblot的方法分析,从而探讨细胞周期蛋白cyclinb1、cycline、bcl-2及bax在gardiquimod对人胰腺癌BxPC-3细胞增殖、迁移及凋亡调控中的作用。
结果:Real-time PCR和Western blot分析证实,在人原位胰腺腺癌BxPC-3细胞中,mRNA及蛋白水平检查到TLR7表达,TLR7受体表达量低于人外周血单核细胞,表达相差20.12±7.254倍,差异有统计学意义(P<0.01)。MTS、流式细胞术及划痕试验分析结果显示:TLR7配体Gardiquimod抑制BxPC-3细胞增殖,且具有时间及剂量依赖性(P<0.05);Gardiquimod诱导胰腺癌BxPC-3细胞凋亡,且具有时间依赖性(P<0.05);Gardiquimod能够抑制胰腺癌BxPC-3细胞迁移,6天后伤痕愈合度仅达到60%,且具有时间依赖性依赖性(P<0.01)。机制研究发现:通过western-blotting的方法来分析,TLR7受体激动剂Gardiquimod能够降低cyclin B1、cyclin E和Bcl-2,同时,Gardiquimod能够上调Bax,6h后可出现明显升高。
结论:TLR7受体在人原位胰腺腺癌Bx PC-3细胞存在表达;TLR7激动剂Gardiquimod能够抑制胰腺癌BxPC-3细胞的增殖、迁移和诱导细胞凋亡。Gardiquimod对胰腺癌BxPC-3细胞增殖抑制及细胞凋亡诱导可能依赖细胞周期蛋白cyclin B1、cyclin E、Bcl-2及Bax的调控。
参考文献
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[5]邹兵兵. Toll样受体7激活对胰腺癌细胞株（BxPC-3）增殖、迁移与凋亡的影响及机制研究[D].安徽医科大学,2015.