背景[1-3]
SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系由OettgenF及其同事从一名29岁的患有广泛、快速进展性恶性黑色素瘤的白人男性患者的胸导管中分离建立的。该细胞可产生黑色素，电镜检测发现细胞中色素颗粒与自身合成和吞噬作用相关。在63%的恶性黑色素瘤患者和10%其他疾病患者体内发现了针对该细胞系的抗体。该细胞为悬浮培养，绝大部分细胞为圆形，少量细胞有拉伸现象，此为正常，请各位学者注意。
SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系
SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系培养操作:
1）复苏SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加1ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为类；
1.细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2.4 min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x106/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3.将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
SK-MEL-5人恶性黑色素瘤贴壁细胞系可以用于鼠miR-763通过靶向GRB2抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移的机制研究
探究miR-763对人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力的影响;
深入探讨miR-763是否靶向人GRB2基因以及发挥抗肿瘤作用的具体分子机制。
方法1.miR-763过表达的稳转细胞系的筛选:miR-763过表达与对照组慢病毒感染人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28,用puromycin筛选稳转细胞系,观察是否有绿色荧光来指示慢病毒感染细胞模型是否构建成功;
2. miR-763高表达对黑色素瘤细胞增殖和迁移的影响:用稳转细胞系进行CCK8实验和Transwell小室实验,观察细胞增殖和迁移能力是否有变化;
3. 检测GRB2是否为miR-763的靶基因:利用双荧光素酶实验和Western blot检测miR-763对GRB2表达的影响;
4. miR-763是否靶向GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用:在黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28中将miR-763均过表达,进行CCK8实验和Transwell小室实验,检测miR-763是否通过GRB2发挥对黑色素瘤的抑制作用;
5. miR-763在人黑色素瘤细胞中发挥作用的具体机制:用Western blot检测GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平的变化;
6. 动物实验检测miR-763过表达对体内黑色素瘤生长的影响:构建裸鼠皮下移植瘤模型,观测并记录肿瘤生长情况,并且提取肿瘤组织蛋白进行Western blot实验检测GRB2下游信号分子蛋白的表达水平。
结果1.在人黑色素瘤细胞的稳转细胞系中,miR-763过表达组细胞相比于对照组,其增殖和迁移能力减弱,表明miR-763过表达可能抑制人黑色素瘤细胞SK-MEL-5和SK-MEL-28的增殖和迁移能力。
2. 双荧光素酶实验证明鼠miR-763和GRB2之间存在靶向关系,并且miR-763过表达下调了GRB2的蛋白表达水平。GRB2过表达能够逆转miR-763 mimic诱导的增殖和迁移的抑制,进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。
3.通过Western blot实验分析发现miR-763过表达下调了GRB2的下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763通过介导p38 MAPK信号通路发挥对黑色素瘤的抑制作用。
4.裸鼠体内实验结果显示,miR-763过表达组肿瘤体积和重量均小于对照组,并且肿瘤组织的Western blot实验结果显示,miR-763过表达下调了GRB2下游信号分子cyclin D3的蛋白表达水平和p38的磷酸化水平,证明miR-763过表达抑制裸鼠黑色素瘤的生长。
结论：研究发现了鼠miR-763过表达抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移能力,并进一步证明GRB2是miR-763的靶基因。miR-763发挥抗肿瘤作用可能是通过靶向GRB2调节p38 MAPK信号通路进而抑制人恶性黑色素瘤细胞的增殖和迁移。因此,这些结果可能在黑色素瘤治疗中有助于药物的研发。
参考文献
[1]miRNA-guided reprogramming of glucose and glutamine metabolism and its impact on cell adhesion/migration during solid tumor progression..Quirico Lorena;Orso Francesca;Cucinelli Stefania;Paradzik Mladen;Natalini Dora;Centonze Giorgia;Dalmasso Alberto;La Vecchia Sofia;Coco Martina;Audrito Valentina;Riganti Chiara;Defilippi Paola;Taverna Daniela.Cellular and molecular life sciences:CMLS,2022
[2]The central moTOR of metabolism.Simcox Judith;Lamming Dudley W..Developmental Cell,2022
[3]YTHDF1 upregulation mediates hypoxia-dependent breast cancer growth and metastasis through regulating PKM2 to affect glycolysis..Yao Xuemei;Li Wei;Li Liqi;Li Menghuan;Zhao Youbo;Fang De;Zeng Xiaohua;Luo Zhong.Cell death&disease,2022
[4]Radiation-induced C-reactive protein triggers apoptosis of vascular smooth muscle cells through ROS interfering with the STAT3/Ref-1 complex..Ryu JeWon;Jung InHye;Park EunYoung;Kim KangHyun;Kim Kyunggon;Yeom Jeonghun;Jung Jinhong;Lee SangWook.Journal of cellular and molecular medicine,2022
[5]李晶晶.鼠miR-763通过靶向GRB2抑制人黑色素瘤细胞的增殖和迁移的机制研究[D].新乡医学院,2022.