背景[1-3]
人B淋巴细胞瘤细胞该细胞来源于一位3岁的白人Burkitt淋巴瘤患者；EBV阴性；表达IL-4受体和低亲和性IgE受体（CD23）；每个细胞表面大约有1500个IL-4的结合位点；分泌IgM（lamdaL）；表达膜型和分泌型的免疫球蛋白。
B细胞淋巴瘤是B细胞发生的实体肿瘤，包括霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤。其分型众多，经典霍奇金淋巴瘤和结节性淋巴细胞为主型霍奇金淋巴瘤，现在被认为是起源于B细胞的肿瘤。弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）、小淋巴细胞淋巴瘤/慢性淋巴细胞白血病、套细胞淋巴瘤（MCL）5种B细胞非霍奇金淋巴瘤最为常见，占非霍奇金淋巴瘤的3/4。B细胞淋巴瘤的预后和治疗取决于淋巴瘤的具体类型以及分期分级。
人B淋巴细胞瘤细胞
人B淋巴细胞瘤细胞培养操作规程：
一．人B淋巴细胞瘤细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基（RPMI-1640，GIBCO）；北美胎牛血清（灭活），10%；双抗1%。
2）人B淋巴细胞瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37℃，培养箱湿度为70%-80%。
3）人B淋巴细胞瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．人B淋巴细胞瘤细胞处理：
1）复苏人B淋巴细胞瘤细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管迅速放入37℃水浴中（水面要低于冻存管盖部）摇晃解冻，移入事先准备好的含有4mL培养基的15ml离心管中混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，加入1mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液移入含有5ml培养基的培养瓶中培养过夜。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于悬浮细胞，传代可参考以下方法：
收集细胞，1000RPM，常温条件下离心5分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀，将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人B淋巴细胞瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。悬浮细胞冻存时，应将细胞收集，1000RPM，常温条件下离心5分钟，少量保存上清液（防止细胞吸走），加入部分新鲜培养基，吹打均匀后，加入到冻存管中，在冻存管中加入10%DMSO摇匀后进行冻存。
应用[4][5]
人B淋巴细胞瘤细胞可以用于EBV体外转染人B淋巴细胞方法的优化及B淋巴母细胞样细胞系的体外建立
探讨CpG基序和CD40激发型抗体(5C11)对EBV转化的作用,从而优化B-LCLs建系的方法,对于体外利用和研究B淋巴细胞株具有重要的理论价值和潜在的运用意义。
EBV体外转染人B细胞方法的优化
探讨体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)的优化方法及其影响因素。
方法：用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CD40激发型抗体(5C11)、CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19的表达水平。
结果：PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B淋巴母细胞系。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体(5C11)及CpG免疫调节基序联合运用,明显地提高了EBV转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。
结论：CD40信号激发和CpG免疫调节基序联合运用有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。
人B淋巴母细胞系的体外建立及生物学活性鉴定
体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)并鉴定其生物学活性。
方法：光学显微镜下观察,并做Giemsa染色,观察LCLs的形态特征;提取LCLs的总RNA,检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1的存在;利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19、CD40的表达水平。
结果：PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B淋巴母细胞系。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。转化后的LCLs含有LMP1基因,并保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。结论用EBV体外转染方法成功建立B淋巴母细胞样细胞系,转化后的B淋巴母细胞能持续分裂,并保持了成熟B淋巴细胞的生物学特性。
参考文献
[1]CD40 signaling activated by Epstein–Barr virus promotes cell survival and proliferation in gastric carcinoma-derived human epithelial cells.Ken-Ichi Imadome;;Norio Shimizu;;Misako Yajima;;Ken Watanabe;;Hiroyuki Nakamura;;Hiroaki Takeuchi;;Shigeyoshi Fujiwara.Microbes and Infection,2009
[2]Functionally significant mutations in the Epstein-Barr virus LMP1 gene and their role in activation of cell signaling pathways.S.V.Diduk;;K.V.Smirnova;;O.A.Pavlish;;V.E.Gurtsevitch.Biochemistry(Moscow),2008
[3]Multiple roles of LMP1 in Epstein-Barr virus induced immune escape.J.M.Middeldorp;;D.M.Pegtel.Seminars in Cancer Biology,2008
[4]Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation..BioDrugs,2007
[5]刘敏娟.EBV体外转染人B淋巴细胞方法的优化及B淋巴母细胞样细胞系的体外建立[D].苏州大学,2009.