背景[1-3]
人结肠癌细胞是一种从结肠癌患者体内分离出来的癌细胞，可以用于研究和治疗结肠癌等多种疾病。
人结肠癌细胞具有一些特征性的生物学特性，例如在标准培养条件下可以自发分化为肠上皮样细胞，并表达一些与肠上皮细胞相关的分子，如角质蛋白等。此外，人结肠癌细胞还可以用于制作肿瘤模型、药物筛选和疫苗研发等多个领域。
其中，Caco-2细胞是从直肠原位癌患者体内分离出来的细胞，在标准培养条件下可以自发分化为肠上皮样细胞，是常用的肠癌细胞模型之一。而人结肠癌组织源细胞则是指从机体取出后立即培养的细胞，这种细胞广泛应用于分子、细胞生物学和生物医学基础研究等多个领域。
人结肠癌细胞
人结肠癌细胞培养步骤：
一．人结肠癌细胞培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基(RPMI-1640:GIBCO,货号31800022,添加NaHCO3 1.5g/L,D-葡萄糖2.5g/L,丙酮酸钠0.11g/L)，90%；优质胎牛血清，10%。
2）人结肠癌细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）人结肠癌细胞冻存液：90%完全培养基，10%DMSO，现用现配。液氮储存。
二．人结肠癌细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10cm皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）人结肠癌细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.将细胞悬液按1：2到1：5的比例分到新的含8ml培养基的新皿中或者瓶中。
3）人结肠癌细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。贴壁细胞冻存时，弃去培养基后加入少量胰酶，细胞变圆脱落后，加入约1ml含血清的培养基后加入冻存管中，再添加10%DMSO后进行冻存。
应用[4][5]
人结肠癌细胞可以用于Weissella cibaria D-2-EPS对人结肠癌细胞抑制作用的研究
目前关于魏斯氏菌的ESP研究主要集中在食品发酵方面,抗癌研究非常少,且相关作用机制未见报道。本研究立足于此,以实验室自行分离的魏斯氏菌为研究对象,提取、分离EPS并描述表征,同时初步探究魏斯氏菌EPS在体内和体外对人结肠癌细胞的抑制作用及可能的作用通路。
方法：对本实验室自行筛选分离出的Weissella cibaria D-2,检测其耐酸耐胆盐特性,并在特定改良MRS培养基中培养以实现量产EPS,然后进一步提取、分离。用苯酚-硫酸法测定提取D-2-EPS中总糖含量占比,用硫酸-咔唑法测定提取EPS中糖醛酸含量占比。用扫描电镜描述EPS形态及元素组成、扫描EPS红外紫外光谱、高效液相色谱法分析EPS的糖及醛酸组成等等表征。通过CCK8和克隆形成检测W.cibaria D-2-EPS对结肠癌细胞的增殖的影响,通过划痕与transwell实验检测对迁移与侵袭能力的影响,通过流式细胞术检测对细胞周期及细胞凋亡的影响。通过qRT-PCR探究可能作用的分子机制。
建立裸鼠HT29皮下异种移植瘤模型,通过瘤内注射实现高中低浓度EPS干预,每3-4天注射一次,4次注射后每只注射EPS总量分别为4 mg、8 mg、12 mg。每天记录肿瘤大小,观察EPS对小鼠皮下肿瘤是否有抑制作用及不同浓度EPS的作用差异,并用免疫组化检测肿瘤组织中Ki67的表达水平。对心、肝、脾、肺、肾取材后行HE染色,确认EPS是否对重要脏器有毒性。
结果：W.cibaria D-2在酸性环境及先酸后胆盐的环境中存活率分别是92.89%、87.42%。D-2-EPS在改良MRS培养基中提取率为39.106 g/L,总糖含量占比为80.15%,糖醛酸含量占比为9.12%。扫描电镜下D-2-EPS呈现光滑偏规则的圆球形或类圆球形,Mapping能谱分析显示C、O元素分别占比75.45%、24.55%,基本不含蛋白质。D-2-EPS是一种杂多糖,由葡萄糖(>98%)、甘露糖、核糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、岩藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸等构成。
体外细胞实验结果显示,W.cibaria D-2-EPS 0.7 mg/mL作用72 h可以抑制结肠癌细胞的增殖(P<0.01)、减弱迁移与侵袭的能力(P<0.01),可以诱导细胞在G1期停留(P<0.01)、促进细胞凋亡进程(P<0.01)。qRT-PCR结果显示EPS可能依赖于PDK2/Akt/mTOR通路发挥作用。
动物实验结果显示,在无明显毒性的前提下,低、中、高浓度的EPS均可抑制结肠肿瘤生长,且高浓度组抑制效果优于低、中浓度组(P<0.05),而低、中浓度组之间没有明显差异。免疫组化结果显示EPS抑制肿瘤组织中Ki67的表达。
结论:W.cibaria D-2具备一定抵抗胃肠液胁迫的能力。W.cibaria D-2-EPS是一种杂多糖,绝大部分由葡萄糖组成。D-2-EPS在体内外实验中均对结肠癌表现出抑制作用,且可能通过PDK2/Akt/mTOR分子途径发挥这种作用。
参考文献
[1]Characterization of Weissella viridescens UCO-SMC3 as a Potential Probiotic for the Skin:Its Beneficial Role in the Pathogenesis of Acne Vulgaris.EspinozaMonje Marcela;Campos Jorge;Alvarez Villamil Eduardo;Jerez Alonso;Dentice Maidana Stefania;Elean Mariano;Salva Susana;Kitazawa Haruki;Villena Julio;GarcíaCancino Apolinaria.Microorganisms,2021
[2]Microbial short-chain fatty acids modulate CD8+T cell responses and improve adoptive immunotherapy for cancer..Luu Maik;Riester Zeno;Baldrich Adrian;Reichardt Nicole;Yuille Samantha;Busetti Alessandro;Klein Matthias;Wempe Anne;Leister Hanna;Raifer Hartmann;Picard Felix;Muhammad Khalid;Ohl Kim;Romero Rossana;Fischer Florence;Bauer Christian A;Huber Magdalena;Gress Thomas M;Lauth Matthias;Danhof Sophia;Bopp Tobias;Nerreter Thomas;Mulder Imke E;Steinhoff Ulrich;Hudecek Michael;Visekruna Alexander.Nature communications,2021
[3]Host-Microbiome Interaction in Lung Cancer.Dong Qiang;Chen Eric S.;Zhao Chen;Jin Chengcheng.Frontiers in Immunology,2021
[4]Control of Immunity by the Microbiota.Ansaldo Eduard;Farley Taylor K.;Belkaid Yasmine.Annual Review of Immunology,2021
[5]都玉蓉.Weissella cibaria D-2-EPS对人结肠癌细胞抑制作用的研究[D].郑州大学,2022.