背景[1-3]
猪肾细胞系是由Stice·E建系于1955年；PK-15细胞是PK-1a细胞的克隆系，PK-15细胞可用于多种病毒的增值及特性研究。另外，电镜观察发现，PK-15细胞内有C-型病毒颗粒存在，是研究C-型病毒的材料。
猪肾细胞系
猪肾细胞系特点：
01细胞贴壁较强
细胞贴壁略偏强，消化时易出现消化时间偏长现象，注意一定要消化到细胞可以轻轻吹下，再加终止液终止消化；
02细胞颗粒比较多
该细胞培养过程中代谢会产生较多颗粒物，细胞内部及细胞周边可以明显看到很多颗粒，此为该细胞正常现象，并不代表细胞状态不佳或污染；消化操作不规范、培养条件不适等会导致细胞颗粒进一步增加，严重的可能会出现细胞不长甚至死亡，对环境和操作要求偏高；
细胞颗粒较多时可以收集细胞后低速离心并用PBS重悬后再低速离心，重复1-2次后再接种到新的培养瓶中；
03细胞消耗培养基偏快
细胞培养基消耗速度偏快，必须多加点培养基培养细胞，T25瓶加10-12ml完全培养基，10cm皿加12-15ml，2-3天换液一次；
猪肾细胞系传代步骤：
如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次；
加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化；
按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀；
收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:4的比例进行。
猪肾细胞系冻存步骤
细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数；
4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10(6)/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识；
将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
猪肾细胞系可以用于猪CAⅢ基因CDS克隆、表达及其对PK15细胞增殖的影响
CAⅢ基因主要在人、鼠肌肉和脂肪表型进行研究,而猪上对细胞增殖的表型研究相对较少。
因此本试验通过RT-PCR和克隆测序获得猪CAⅢ基因的CDS序列;通过生物信息学技术预测该基因编码的蛋白质的结构、功能、定位等;利用qRT-PCR技术检测CAⅢ基因的时空表达特征;利用同源重组方法和CRISPR/Cas9技术构建pcDNA 3.1-EGFP-CAⅢ过表达载体及敲除载体,并转染至PK15细胞中,qRT-PCR检测细胞增殖和凋亡相关基因ki67、Casparse3和Parp2 mRNA表达量,CCK-8检测细胞增殖率;通过在PK15细胞中添加甲基化抑制剂试验检测CAⅢ基因是否受DNA甲基化调控,以探讨CAⅢ基因对细胞增殖的影响及作用机制。
试验结果表明,CAⅢ编码260个氨基酸。由α-螺旋及β-转角等折叠形成一个无信号肽在细胞质发挥作用的亲水性碱性蛋白。
CAⅢ基因在各个组织中均有表达。大白猪和马身猪在0、1、2月龄低表达且差异不显著,在3月龄逐渐增加且差异极显著,4月龄开始下降,5月龄(马身猪)开始升高且表达量最高。功能验证结果表明,pcDNA3.1-EGFP-CAⅢ载体转入PK15细胞中,细胞增殖基因ki67 mRNA表达量增加,凋亡基因Caspare3和Parp2 mRNA减少,且细胞增殖率增加,pHS-CR054-CAⅢ试验结果反之。
甲基化试验结果表明,添加20μmol/L甲基化抑制剂,CAⅢmRNA表达量增加,但是PK15细胞增殖率降低。本研究成功克隆了猪CAⅢCDS区并分析该基因的生物信息学及时空表达特性。成功构建过表达和敲除载体探讨CAⅢ基因对细胞增殖作用,并验证CAⅢ基因受甲基化的调控,该基因可能受DNA甲基化的调控从而对细胞增殖产生影响。
参考文献
[1]Crystallography and Its Impact on Carbonic Anhydrase Research.Carrie L.Lomelino;;Jacob T.Andring;;Robert McKenna;;Qi-Dong You.International Journal of Medicinal Chemistry,2018
[2]Protective Role of Carbonic Anhydrases III and VII in Cellular Defense Mechanisms upon Redox Unbalance.Anna Di Fiore;;Daria M.Monti;;Andrea Scaloni;;Giuseppina De Simone;;Simona M.Monti;;Reiko Matsui.Oxidative Medicine and Cellular Longevity,2018
[3]Carbonic anhydrase III protects osteocytes from oxidative stress.Chao Shi;;Yuhei Uda;;Christopher Dedic;;Ehab Azab;;Ningyuan Sun;;Amira I.Hussein;;Christopher A.Petty;;Keertik Fulzele;;Maria C.Mitterberger-Vogt;;Werner Zwerschke;;Renata Pereira;;Kunzheng Wang;;Paola Divieti Pajevic.The FASEB Journal,2018
[4]Insights into the role of reactive sulfhydryl groups of Carbonic Anhydrase III and VII during oxidative damage.Daria M.Monti;;Giuseppina De Simone;;Emma Langella;;Claudiu T.Supuran;;Anna Di Fiore;;Simona M.Monti.Journal of Enzyme Inhibition and Medicinal Chemis,2017
[5]乐宝玉.猪CAⅢ基因CDS克隆、表达及其对PK15细胞增殖的影响[D].山西农业大学,2020.