背景[1-3]
小鼠黑色素瘤细胞是一种常用的细胞系，用于研究黑色素瘤的发生、发展和治疗。B16-F10是其中一种小鼠黑色素瘤细胞系，来源于C57BL/6J小鼠的皮肤。
小鼠黑色素瘤细胞B16-F10是来源于C57BL/6J小鼠自发性肿瘤细胞，在显微镜下呈成纤维细胞样。这种细胞的增殖能力很强，仅需接种少量细胞，便可在数天后形成克隆。另外它还具有侵袭性强、成瘤率高等特点，被认为是构建肿瘤模型理想的细胞，几乎所有科研人员建立肿瘤模型时会考虑使用B16-F10细胞。
小鼠黑色素瘤细胞
近年来，黑色素瘤发病率逐年上升，恶性黑色素瘤（malignant melanoma，MM）是皮肤黑色素细胞来源的恶性肿瘤，具有转移快、预后差、生存期短等特点。据统计，晚期黑色素瘤患者平均生存期短于1年，5年生存率低于10%。因此，常用于构建小鼠黑色素瘤细胞模型的B16-F10细胞，对黑色素瘤转移和治疗的研究具有重要意义。
在科研中，小鼠黑色素瘤细胞B16-F10常被用于研究黑色素瘤的发病机制、浸润转移以及药物治疗反应等，为改善肿瘤患者预后提供了重要的研究工具。同时，这种细胞模型还可以用于研究免疫治疗方法对黑色素瘤的效果，为临床治疗提供新的思路。
小鼠黑色素瘤细胞培养步骤：
一．培养基及培养冻存条件准备：
1）准备RPMI-1640培养基；优质胎牛血清，10%；双抗，1%。
2）小鼠黑色素瘤细胞培养条件：气相：空气，95%；二氧化碳，5%。温度：37摄氏度，培养箱湿度为70%-80%。
3）小鼠黑色素瘤细胞冻存液：90%血清，10%DMSO，现用现配。
二．小鼠黑色素瘤细胞处理：
1）复苏细胞：将含有1mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入4mL培养基混合均匀。在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入250px皿中，加入约8ml培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2）细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
对于贴壁细胞，传代可参考以下方法：
1.弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
2.加2ml消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，置于37℃培养箱中消化1-2分钟，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
3.按6-8ml/瓶补加培养基，轻轻打匀后吸出，在1000RPM条件下离心4分钟，弃去上清液，补加1-2mL培养液后吹匀。
4.收到细胞后首次传代推荐将细胞悬液按1：2的比例分到新的含6ml培养基的新皿中或者瓶中，建议客户冻存一支备用，后续传代根据实际情况按1:2到1:5的比例进行。
3）小鼠黑色素瘤细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。
1，细胞冻存时，弃去培养基后，PBS清洗一遍后加入1ml胰酶，细胞变圆脱落后，加入1ml含血清的培养基终止消化，可使用血球计数板计数。
2，4min 1000rpm离心去掉上清。加1ml血清重悬细胞，根据细胞数量加入血清和DMSO，轻轻混匀，DMSO终浓度为10%，细胞密度不低于1x10E6/ml，每支冻存管冻存1ml细胞悬液，注意冻存管做好标识。
3，将冻存管置于程序降温盒中，放入-80度冰箱，至少2个小时以后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4][5]
小鼠黑色素瘤细胞可以用于SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究
黑色素瘤是由黑色素细胞恶变产生的一种恶性肿瘤,是所有皮肤癌患者死亡的主要原因。白藜芦醇是一种多酚类化合物,具有广泛药理学活性,如抗炎、抗氧化、抗肿瘤和抗老化等特性。黑色素瘤的异常细胞增殖及转移受多种生物学过程影响,SHC结合蛋白1(SHCBP1)参与多种细胞过程,与许多肿瘤发生发展相关。有文献报道白藜芦醇抑制黑色素瘤细胞增殖,但并未完全解析白藜芦醇抑制黑色素瘤细胞增殖的分子机理。
实验基于前期研究发现白藜芦醇抑制小鼠黑色素瘤B16细胞中SHCBP1的表达水平的结果,采用CCK-8、流式细胞术、Western Blot、Ed U染色等方法阐明白藜芦醇在抑制小鼠黑色素瘤(B16)细胞的分子机制,并进一步阐明SHCBP1在B16细胞中的生物学作用。
本研究主要获得实验结果如下:1、白藜芦醇抑制B16细胞增殖、细胞集落形成和细胞迁移。这种影响是由于白藜芦醇抑制B16细胞中ERK及AKT信号通路,并促进细胞周期抑制因子p21、p27、p53蛋白的表达。同时发现白藜芦醇抑制B16细胞中SHCBP1蛋白的表达。
2、SHCBP1在B16细胞中本底表达较高。通过获得干扰SHCBP1的B16细胞株,利用转录组测序分析差异基因KEGG通路,发现差异基因主要富集在细胞增殖、凋亡、氧化及炎症相关通路,说明SHCBP1的确影响B16细胞增殖。
3、在B16细胞中单独干扰和超表达SHCBP1,结果发现SHCBP1加速B16细胞G1/S期进程,促进ERK和AKT的磷酸化,进一步影响Cyclin D1和P21的表达水平,从而调控细胞增殖过程。
4、分别在SHCBP1干扰和超表达的情况下,用白藜芦醇处理B16细胞,结果发现,白藜芦醇抑制SHCBP1的表达,调控ERK信号通路从而影响B16细胞的细胞增殖,另一方面,白藜芦醇也通过AKT信号通路发挥调控B16细胞增殖效应。
结论:本研究阐明白藜芦醇通过抑制SHCBP1/ERK和AKT信号通路抑制小鼠黑色素瘤B16细胞增殖及迁移能力。为白藜芦醇临床治疗提供实验支撑,SHCBP1作为治疗黑色素瘤的临床诊断和靶向治疗提供理论依据和实验基础。
参考文献
[1]SHCBP1 interacting with EOGT enhances O-GlcNAcylation of NOTCH1 and promotes the development of pancreatic cancer.Yang Can;Hu Jian-Fei;Zhan Qian;Wang Zu-Wei;Li Ge;Pan Jing-Jing;Huang Long;Liao Cheng-Yu;Huang Yi;Tian Yi-Feng;Shen Bai-Yong;Chen Jiang-Zhi;Wang Yao-Dong;Chen Shi.Genomics,2021
[2]FGF13 interaction with SHCBP1 activates AKT-GSK3α/βsignaling and promotes the proliferation of A549 cells.Lu Hongzhao;Yin Meichen;Wang Ling;Cheng Jia;Cheng Wei;An Huanping;Zhang Tao.Cancer Biology&Therapy,2020
[3]NRASQ61K melanoma tumor formation is reduced by p38-MAPK14 activation in zebrafish models and NRAS-mutated human melanoma cells..Banik Ishani;Cheng Phil F;Dooley Christopher M;Travnickova Jana;Merteroglu Munise;Dummer Reinhard;Patton Elizabeth E;BuschNentwich Elisabeth M;Levesque Mitchell P.Pigment cell&melanoma research,2020
[4]Curcumol inhibits the proliferation and metastasis of melanoma via the miR-152-3p/PI3K/AKT and ERK/NF-κB signaling pathways..Ning Ning;;Liu Sulai;;Liu Xiehong;;Tian Zeyu;;Jiang Yu;;Yu Nanhui;;Tan Boyu;;Feng Hao;;Feng Xing;;Zou Lianhong.Journal of Cancer,2020
[5]孙志阳.SHCBP1介导白藜芦醇调控小鼠黑色素瘤细胞增殖及迁移的机制研究[D].陕西理工大学,2021.