背景[1-3]
EB病毒感染的人外周淋巴细胞是J.V.Melo从一位63岁患有套细胞淋巴瘤白人女性外周血中分离建立的，经EBV介导获得永生化，该细胞表达p16和细胞周期蛋白D2,低水平表达细胞周期蛋白D1。
EB病毒感染的人外周淋巴细胞是指在EB病毒感染者的外周血中检测到的EB病毒感染的淋巴细胞。这些细胞通常表现为EB病毒核抗原(EBNA)阳性，但不表达EB病毒早期抗原(EA)和EB病毒壳抗原(VCA)。此外，这些细胞还可能表达EB病毒受体CD21和CD23。
通过检测EB病毒感染的人外周淋巴细胞，可以帮助诊断EB病毒感染，尤其是在没有明显症状的情况下。此外，这种检测还可以用于监测EB病毒感染的治疗效果。
EB病毒感染的人外周淋巴细胞
EB病毒感染的人外周淋巴细胞会发生变化。EB病毒主要感染人类口咽部的上皮细胞和B淋巴细胞。在感染过程中，EB病毒能使B淋巴细胞转化，使其成为连续分裂、永久生存的类淋巴母细胞样细胞，即永生化细胞。这种转化后的细胞称为永生细胞株，每一永生细胞株都保存了原来提供血样个体的完整基因组，为研究世界上不同人种、不同民族的遗传结构，不同个体、不同人群对疾病的易感性，特别是对家族性遗传疾病和地方性疾病的易感性，提供了宝贵的遗传资源。
EB病毒感染的人外周淋巴细胞培养操作
1)复苏EB病毒感染的人外周淋巴细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)EB病毒感染的人外周淋巴细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)EB病毒感染的人外周淋巴细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
EB病毒感染的人外周淋巴细胞用于EBV体外转染人B淋巴细胞方法的优化及B淋巴母细胞样细胞系的体外建立
病毒转化后的B淋巴母细胞样细胞系(B-LCLs)依然保存了B细胞的分化特征和免疫表型,作为抗原提呈细胞,它可以摄取加工抗原,并将其载体部分表达于细胞表面,供T细胞受体识别;也可作为抗体基因的来源,将其与骨髓瘤细胞融合,制备分泌相应的单克隆抗体的杂交瘤细胞株。
探讨CpG基序和CD40激发型抗体(5C11)对EBV转化的作用,从而优化B-LCLs建系的方法,对于体外利用和研究B淋巴细胞株具有重要的理论价值和潜在的运用意义。
EB病毒感染的人外周淋巴细胞方法的优化目的探讨体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)的优化方法及其影响因素。
方法：用EB病毒感染健康人外周血中分离的单个核细胞(PBMC),加入CD40激发型抗体(5C11)、CpG DNA免疫调节基序以诱导B淋巴细胞增殖,环胞菌素A(CysA)抑制T淋巴细胞的活性。光学显微镜下观察LCLs的形态特征,利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19的表达水平。结果PBMC经EBV感染3周后转化成永生化B淋巴母细胞系。转化后的B淋巴母细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。CD40激发型抗体(5C11)及CpG免疫调节基序联合运用,明显地提高了EBV转化效率,转化后的LCLs保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。结论CD40信号激发和CpG免疫调节基序联合运用有效地促进EBV对人B淋巴细胞的转化及体外建系。
EB病毒感染的人外周淋巴细胞的体外建立及生物学活性鉴定
目的体外建立健康人外周血的B淋巴母细胞样细胞系(LCLs)并鉴定其生物学活性。
方法：光学显微镜下观察,并做Giemsa染色,观察LCLs的形态特征;提取LCLs的总RNA,检测EB病毒潜伏膜蛋白基因LMP1的存在;利用流式细胞术分析LCLs膜表面分子CD19、CD40的表达水平。
结果PBMC经EBV感染3周后转化成EB病毒感染的人外周淋巴细胞。EB病毒感染的人外周淋巴细胞体积增大积聚成团,可进一步分裂增殖并长期传代培养。转化后的LCLs含有LMP1基因,并保持了成熟B淋巴细胞的生物学特征。
参考文献
[1]CD40 signaling activated by Epstein–Barr virus promotes cell survival and proliferation in gastric carcinoma-derived human epithelial cells.Ken-Ichi Imadome;;Norio Shimizu;;Misako Yajima;;Ken Watanabe;;Hiroyuki Nakamura;;Hiroaki Takeuchi;;Shigeyoshi Fujiwara.Microbes and Infection,2009
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[3]Multiple roles of LMP1 in Epstein-Barr virus induced immune escape.J.M.Middeldorp;;D.M.Pegtel.Seminars in Cancer Biology,2008
[4]Therapeutic Applications of Synthetic CpG Oligodeoxynucleotides as TLR9 Agonists for Immune Modulation..BioDrugs,2007
[5]刘敏娟.EBV体外转染人B淋巴细胞方法的优化及B淋巴母细胞样细胞系的体外建立[D].苏州大学,2009.