背景[1-3]
大鼠正常肝细胞是一种常用的实验细胞系，用于研究肝脏的生理、病理和药物代谢等方面。这些细胞通常来自SD大鼠的正常肝组织，通过贴壁生长和传代培养等方法进行保种和繁殖。
大鼠正常肝细胞具有一些重要的生物学特性，如多角形或三角形形态、核仁明显、细胞质丰富等。这些细胞能够进行各种代谢活动，如蛋白质合成、糖代谢、脂肪代谢等，并且可以参与药物的生物转化过程。
大鼠正常肝细胞
大鼠正常肝细胞培养操作
1)复苏大鼠正常肝细胞：以下细胞培养冻存处理仅供参考，具体操作步骤以随货产品说明书为主。
将含有1 mL细胞悬液的冻存管在37℃水浴中迅速摇晃解冻，加4 mL培养基混合均匀。在1000 rpm条件下离心3 min，弃去上清液，加1-2 mL培养基后吹匀。然后将所有细胞悬液加入含适量培养基的培养瓶中培养过夜（或将细胞悬液加入10 cm皿中，加入约8 mL培养基，培养过夜）。第二天换液并检查细胞密度。
2)大鼠正常肝细胞传代：如果细胞密度达80%-90%，即可进行传代培养。
a、弃去培养上清，用不含钙、镁离子的PBS润洗细胞1-2次。
b、加1 mL消化液（0.25%Trypsin-0.53mM EDTA）于培养瓶中，使消化液浸润所有细胞，弃去消化液，将培养瓶置于37℃培养箱中消化1 min，然后在显微镜下观察细胞消化情况，若细胞大部分变圆并脱落，迅速拿回操作台，轻敲几下培养瓶后加少量培养基终止消化。
c、按6-8 mL/瓶补加培养基，轻轻打匀后装入无菌离心管中，1000 rpm离心4 min，弃去上清液，补加1-2 mL培养液后吹匀。
d、将细胞悬液按1:2比例分到新的含8 mL培养基的新皿中或者瓶中，置于培养箱中培养。
3)大鼠正常肝细胞冻存：待细胞生长状态良好时，可进行细胞冻存。下面T25瓶为例；
a、收集细胞及细胞培养液，装入无菌离心管中，1000 rpm条件下离心4 min，弃去上清液，用PBS清洗一遍，弃尽PBS，进行细胞计数。
b、根据细胞数量加入无血清细胞冻存液，使细胞密度5×106~1×107/mL，轻轻混匀，每支冻存管冻存1mL细胞悬液，注意冻存管做好标识。
c、将冻存管放入-80℃冰箱，24 h后转入液氮灌储存。记录冻存管位置以便下次拿取。
应用[4-5]
大鼠正常肝细胞可以用于SPINK3调节大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖的分子机理研究
丝氨酸蛋白酶抑制剂Ⅲ(serine peptidase inhibitor,Kazal type 3,SPINK3)不仅是一种胰蛋白酶抑制剂,而且是一类结构与表皮生长因子(epidermal growth factor,EGF)相似的信号分子,能够与EGFR结合进而促进细胞增殖。本实验室在研究大鼠肝再生功能基因组学的基础上,发现SPINK3在大鼠再生肝中表达显著增强。
深入研究SPINK3调控大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖的分子机理。为了解SPINK3在大鼠肝再生中调控肝细胞增殖的作用及其调节机理,本文用大鼠全基因组芯片Rat Genome 230 2.0检测部分肝切除后再生肝的基因表达变化,发现SPINK3在部分肝切除(partial hepatectomy,PH)后2-24 h和72-168 h表达显著上调,其促进细胞增殖的过程基本与大鼠肝再生进程相符,本文用qRT-PCR和Western Blot验证芯片检测结果的可靠性。
结合文献资料用IPA(Ingenuity Pathway Analysis 9.0,IPA)软件构建SPINK3调控肝再生的信号网络并分析其可能的作用机理,表明SPINK3可与EGFR结合,通过p38MAPK、PKC、JAK-STAT和AKT等四条信号通路调控肝细胞增殖,进一步分析表明,上述四条信号通路均对细胞增殖起到促进作用。综上所述,SPINK3在大鼠肝再生中可能通过上述信号通路促进肝细胞增殖,进而促进肝脏再生。为验证上述推测,本文用基因添加和干涉的方法处理BRL-3A细胞,对SPINK3调节BRL-3A细胞增殖的分子机理进行了初步研究。
首先构建了SPINK3的过表达载体pCDH-CMV-MCS-EF1-copGFP-SPINK3,包装慢病毒后侵染BRL-3A细胞,筛选出阳性单克隆,以获得能够稳定过表达SPINK3的BRL-3A细胞。同时设计并合成了两条SPINK3特异性小干扰RNA(small interfering RNA,siRNA)片段,脂质体转染法转染BRL-3A细胞后,运用qRT-PCR筛选出最佳干涉片段,进而获得干涉SPINK3表达的BRL-3A细胞。MTT法分析SPINK3表达变化对BRL-3A细胞活力的影响,结果显示SPINK3过表达组细胞在24、48、72和96 h的细胞活性均比其对照组高;而转染siRNA1后,BRL-3A细胞在48和72 h细胞生长明显受到抑制。通过BrdU掺入法分析干涉SPINK3表达对BRL-3A细胞增殖的影响,发现siRNA1转染BRL-3A细胞后48 h细胞增殖明显受到抑制;利用流式细胞术检测SPINK3表达变化对BRL-3A细胞增殖和细胞凋亡的影响,发现过表达SPINK3基因对BRL-3A细胞增殖有促进作用,对BRL-3A细胞凋亡有显著抑制作用(P<0.05);而干涉SPINK3基因表达则显著抑制BRL-3A细胞增殖(P<0.05),促进BRL-3A细胞凋亡。
用qRT-PCR和Western Blot等方法检测上述材料的SPINK3及其受体EGFR和相应信号通路的相关基因和蛋白的表达变化,进而分析大鼠肝再生中SPINK3调控肝细胞增殖的机理。结果表明,过表达SPINK3时,SPINK3信号通路基因ERK1、AKT1、STAT3,转录因子NF-κB1及其下游靶基因CCND1等表达上调;siRNA干涉SPINK3表达时,这些基因和蛋白表达下调。
由此得出结论,SPINK3通过调节ERK1、STAT3和AKT1等基因的表达,激活ERK1/2、JAK-STAT和PI3K-AKT三条信号通路,进而调节下游细胞增殖和凋亡相关转录因子CCND1、NF-κB1、BAX、CASPASE3等的表达,最终调控体外培养的大鼠正常肝细胞BRL-3A的增殖和凋亡。
参考文献
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[2]Heterologous recombinant protein with decapacitating activity prevents and reverts cryodamage in ram sperm:An emerging biotechnological tool for cryobiology.L.Zalazar;;A.Ledesma;;F.Hozbor;;A.Cesari.Animal Reproduction Science,2016
[3]Cooperation of C/EBP family proteins and chromatin remodeling proteins is essential for termination of liver regeneration.Jingling Jin;;Il‐Hwa Hong;;Kyle Lewis;;Polina Iakova;;Meghan Breaux;;Yanjun Jiang;;Emily Sullivan;;Nicole Jawanmardi;;Lubov Timchenko;;Nikolai A.Timchenko.Hepatology,2015
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[5]杨婧.SPINK3调节大鼠正常肝细胞BRL-3A增殖的分子机理研究[D].河南师范大学,2017.